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一、立项依据与研究内容
(一)项目的立项依据
DNA错配修复(mismatchrepair,MMR)系统普遍存在于生物体中,它是细胞复制后的一种修复机制[1-3]。
其功能是在含有错配碱基的DNA分子中切除配对错误的片段,然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶等的作用,从头合成配对正确的片段,使DNA恢复正常的核苷酸序列。
因此,它起着增强DNA复制保真度、修复DNA错配、降低基因变异和维持基因组稳固性的作用[4-5]。
近来,MMR系统的研究愈来愈受重视,对MMR作用机制及该系统的组成结构与功能分析方面的研究正不断深切[6-8]。
由于在愈来愈多的肿瘤(如卵巢癌、肠癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、甲状腺肿瘤等)细胞中找到DNAMMR基因突变或缺点的痕迹[9-11]。
MMR系统与肿瘤的发生与恶化的关系成为近十年来的研究热点,MMR基因也成为继癌基因与抑癌基因以后被确认的第三类肿瘤相关基因[4]。
外源性的持续刺激是细胞复制显现DNA错配的重要缘故之一,而日趋严峻的化学污染又使生物受到的外源毒素刺激与日俱增,生物细胞内DNA损伤与错配概率因此也急剧增加[12-15]。
错配的DNA序列若是不能取得修复,将致使突变频率增加,基因突变事件放大,最终会引发肿瘤等相关疾病的发生进展。
事实上,人类MMR系统不仅能识别多种需要进行核苷酸切除与从头合成的DNA错配,还能参与如O6-甲基鸟嘌呤和UV诱导的光产物等造成的DNA损伤的修复[16-19]。
这说明MMR系统极可能参与了暴毒后DNA损伤的修复。
还有研究显示,毒物暴露不但会使DNA错配概率显著提高而增加MMR系统的负荷,而且有些致癌物可能会直接损害MMR基因,使MMR活性降低乃至丧失。
其中,Feitsma等通过利用强致癌物乙基亚硝基脲来诱变取得MSH2、MLH1、MSH6和PMS2等MMR基因缺点型斑马鱼确实是一个重要的例证[20-26]。
因此,日趋严峻的环境污染对生物及人类组成的健康风险之一可能确实是阻断或干扰细胞的DNAMMR活性。
但是,目前将DNAMMR活性分析与环境毒理学相结合的研究在国际上仍为空白,这与当前DNAMMR活性分析方式较为繁琐及环境毒理研究对所需的异源核酸分子的质与量要求很高有关。
除本课题拟开展的活细胞DNAMMR活性分析技术之外,生物体MMR功能的要紧分析方式还有两种。
第一种是以噬菌体M13mp2及其衍生株为材料[27-30],该法利用噬菌体M13mp2及其一种衍生株作为材料,各自提供一条正链ssDNA和一条负链ssDNA,这两条ssDNA退火杂交后可形成一个带预设错配位点的环状异源dsDNA。
将这种含错配碱基的异源dsDNA转入自身错配修复功能缺失的宿主菌(NR9160),在培育平板上就会显现混合噬斑。
若将这种异源dsDNA与样本细胞提取物在体外作用后再次转化NR9162,样本细胞的MMR系统对错配位点的修复情形可通过指示板上的混合噬斑比率的转变来指示,进而分析样本的DNAMMR活性。
第二种以寡聚核苷酸为材料[31],该法采纳人工合成的寡聚核苷酸来制备含有错配碱基的异源dsDNA,在错配碱基处预设特异性限制性内酶切位点.若是待测样本的MMR功能完整,其提取物在体外与这种异源dsDNA作用后,在错配碱基取得修后异源dsDNA即变成同源dsDNA,预设的酶切位点也就同步恢复。
通过电泳检测修复后的dsDNA的限制性酶切产物的有无和多少来对样本MMR功能做定性或初步的定量分析。
这两种方式自成立后,在必然程度上增进了对DNAMMR功能活性研究的进展,但也都存较大的局限性。
第一,这三种方式均为体外法,不能准确反映生物体内的真实状况。
第二,分析进程复杂,需要多个步骤,而且指标参数的灵敏度和准确度都较低。
由于这些方式仅限于特定生物体MMR活性的体外分析,很难在实际研究中普遍推行,这在必然程度上致使了国内在该研究领域力量比较薄弱的局面。
可是,复旦大学的王怡等[32]曾运用上述第一个方式成立了一个类似的DNAMMR活性体外分析模型,用以对淋巴瘤细胞的DNAMMR活性进行分析。
为了克服冲破这些限制,美国得州大学孙鲁浙教授领衔的研究团队于2004年提出了一种利用绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因作为报告基因直接对活细胞DNAMMR活性进行定量分析的模型[33]。
该模型的原理是构建一对EGFP基因真核表达双链核酸分子,其中一个为碱基序列正确的同源双链核酸分子,能够在细胞中正常地表达EGFP;另一个为带一个错配碱基的异源双链核酸分子,那个错配碱基设计在EGFP基因的起始密码子处。
将异源双链核酸分子导入活细胞,若是错配没有修复,细胞就不能表达EGFP。
因此,把这对EGFP双链核酸分子平行地导入细胞中,并检测其组间的EGFP表达率与表达强度,就能够够评估该细胞株DNAMMR活性的强弱。
绿色荧光蛋白的发明及其在生物学研究中的应用取得2008年度诺贝尔奖,将其用于DNAMMR活性的定量检测具有显著的创新意念。
但在随后的应用中,人们发觉该模型的异源双链核酸分子存在必然的EGFP本底表达(即错配未修复也有必然量的绿色荧光蛋白表达),缘故是细胞内基因的表达并非完全依托于起始密码子。
另外,如何大量取得高纯度核酸分子也是制约该技术应用的一个瓶颈。
近来,本课题组通过与孙教授的合作而引入此项技术。
目前,本课题组已在此项技术的应用上取得了两项冲破:
(1)采取无义突变策略(在EGFP基因适合位置引入终止密码子),成立了一种新的突变型EGFP表达质粒p189,运用质粒p111和p189所取得的异源双链核酸分子完全排除该模型EGFP的本底值问题[34],达到了能精准区分MMR活性缺失的细胞株和正常的细胞株(见插图);
(2)开发出了一种为该模型大量制备高纯度ssDNA的技术[详见前期基础],为此项技术在毒理学及其它领域的推行应用提供了技术保障。
本项目拟在前期研究的基础上,为该EGFP双链核酸模型再引入一个红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)基因作为报告基因,构建一个全新的双荧光蛋白基因双链核酸分子(含有同时可表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因)。
该模型的技术改良特点是:
⑴让双链核酸分子自身多带了一个RFP报告基因,可直接定量指示转染效率,而当前技术需要采纳与RFP表达质粒共转染的方式;⑵只需要制备一种带错配的异源核酸底物,无需再制备一种无错配的同源核酸底物;⑶检测进程只需将异源核酸底物导入活细胞中,无需再设空白对照组和同源核酸底物组。
由此可见,新模型的思路是将所有参数在一组细胞中同时取得,而原方式的不同参数需要在不同的细胞组中取得。
因此,新模型由于所有参数完全同步而具更的精准度与灵敏度,而且还可起到简化分析和提高效率的作用。
可是,通过优化的检测模型在细胞毒理学研究方面的前景如何?
这就需要进行科学与系统的验证与评估。
因此,本课题拟先用已知的强致癌化学污染物乙基亚硝基脲来验证该模型应用于细胞毒性研究的适用性,再用几种已知的具有DNA突变和致癌毒性的化学污染物(如铬(Cr)、镉(Cd)、砷(As)、多氯联苯(PCBs)、多环芳烃(PAHs)和DDT等)及几种毒性较弱的新型持久性有机污染物(如全氟辛烷磺酸(PFOS)、多溴二苯醚(PBDE)和双酚A(BPA)等)来评估该模型应用于细胞毒性研究的优越性。
若是活细胞MMR功能活性分析模型能够应用于环境毒理学研究中,咱们不仅可为环境污染物的致突变毒性、遗传毒性与致癌毒性的定量评判增加一个强有力的选项,更能够在微观上挖掘环境污染物生物毒性的分子机制。
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34.Zhou,B,HuangC,YangJ,LuJ,DongQ,SunL.PreparationofheteroduplexEGFPplasmidforinvivomismatchrepairactivityassay.AnalBiochem,2009,AvailableonlineinFebruary26,二)项目的研究内容、研究目标,和拟解决的关键科学问题
1.研究内容
(1)双色荧光蛋白表达质粒的构建:
采纳双顺反子克隆技术将p111和p189改造成EGFP(绿色荧光蛋白)和RFP(红色荧光蛋白)基因顺反子表达质粒pEGFP-IRES-DsRed和pmtEGFP-IRES-DsRed,使EGFP和RFP处在同一条mRNA上同步翻译,取得的质粒pEGFP-IRES-DsRed可同时表达EGFP和RFP,而质粒pmtEGFP-IRES-DsRed由于EGFP基因上带有无义突变,只表达RFP。
(2)活细胞DNAMMR活性双色荧光核酸表达分析模型的成立:
用pEGFP-IRES-DsRed获取ssDNA,与线性化的pmtEGFP-IRES-DsRed退火制备带缺刻的双荧光蛋白基因异源核酸分子,取得的双荧光蛋白基因异源核酸分子在EGFP基因上带有一个T/G错配。
用上述所成立的双荧光蛋白基因异源核酸分子转染活细胞,每一个成功转染的细胞都会表达RFP。
若该细胞具有错配修复能力,将T/G错配修复后,它就会同时表达EGFP。
通过流式细胞仪检测EGFP和RFP表达情形,即可分析活细胞内的DNAMMR活性。
(3)新模型应用于细胞毒理学研究的适用性研究:
先用已知的强致癌化学污染物乙基亚硝基脲(具有MMR基因突变毒性)来验证上述成立的活细胞DNAMMR活性检测新模型是不是能够应用于细胞毒理学的研究。
然后,再用已知的具有DNA突变和致癌毒性的化学污染物(如Cd、As、PCBs、PAHs、DDT等)和毒性较低且致癌效应不明的新型污染物(如PFOS、PBDE、BPA等)来评估该模型应用于细胞毒理学研究的优越性。
2.研究目标:
通过以上研究内容的实施,本课题将在成立活细胞DNAMMR活性分析新模型的基础上,验证与评估该项技术应用于细胞毒理学研究的前景与优越性。
这不仅可为化学污染物的致突变毒性、遗传毒性和致癌毒性的定量评判提供一种新方式,而且还具有推行到癌症发病机制研究等领域的前景,和在微观上挖掘环境污染物生物毒性的分子机制。
3.拟解决的关键问题
(1)本项目拟构建的双色荧光蛋白表达质粒在表达EGFP基因与RFP基因时,二者必需同步,但又相对独立,一方的表达可不能抑制或增强另一方的表达,即两个基因在表达时彼其间可不能显现拮抗或协同效应。
因此,成功构建符合上述要求的双色荧光蛋白表达质粒是本项目的一个关键所在。
(2)若是确认本项目成立的活细胞DNAMMR活性分析新模型在细胞毒理学研究中具有应用前景,这必将为环境毒物致癌与致突变毒性的定量评判开辟一条新途径。
另外,由于DNAMMR活性是许多肿瘤疾病发生与进展的诱因,该模型的成立与应用必然能够增进环境污染与疾病发生内在关联研究的进步。
(三)拟采取的研究方案及可行性分析
1.研究方案
(1)双色荧光蛋白表达质粒的构建:
①实验材料:
EGFP正常表达型质粒p111、无义突变型EGFP质粒p189、双顺反子表达载体pIRES2-DsRed(clontech)、Pfu高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶、DpnI内切酶、dNTPs(脱氧核糖核苷酸)和引物等。
②以pIRES2-DsRed载体为摸板,设计引物,扩增出含IRES表达元件的RFP基因片段IRES-DsRed,对IRES-DsRed片段进行双酶切与纯化。
③对证粒p111和p189别离进行双酶切,回收大片段。
然后,别离放到两个无菌的EP管中,依照1:
3的摩尔比例加入双酶切并纯化后的IRES-DsRed基因片段,再加入T4DNA连接酶,16℃留宿温育进行连接反映。
④从两管连接产物中各取10ng别离转染
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