大学本科生物化学实验理论.docx
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大学本科生物化学实验理论
层析技术方法简介
层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别(分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相,其中一个是固定相,另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。
根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下,
(1)分配层析
(2)离子交换层析(3)凝胶过滤层析(4)亲和层析(5)吸附层析
一、离子交换层析
㈠基本流程
上样;洗脱(pH梯度洗脱;或离子强度梯度洗脱);检测、记录分部收集。
㈡离子交换分离基本原理
不同氨基酸(蛋白质、酶、蛋白激素等)等电点不同,在同pH条件下带电性能不同,与交换剂结合力大小不同,结合较松的先被洗脱出来,结合较紧的后被洗脱出来,从而被分开。
阳离子交换剂交换原理:
++ RC-C1++C2 RC-C2++C1
㈢离子交换层析过程中的关键技术
1、交换剂处理
①漂洗目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒(这一步一定要到做位。
留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。
)直至水清澈无色。
②处理用酸碱轮换浸泡,以便使交换剂带上需要的平衡离子。
③平衡经处理后,要用大量的水悬浮交换剂,最后用缓冲液平衡
2、 柱的选择与装柱
装填均匀,松紧一致,没有气泡,没有裂缝。
3、 上样要求
加入样品液的体积一般应小于床体积的1/3o
4、 洗脱剂
原则四条:
①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液(如氨基乙酸、铉盐、Tris等),阳离子交换剂选用阴离子缓冲液(如乙酸盐、磷酸盐等),以防缓冲离子参与交换过程,降低交换剂的交换容量。
②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。
③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。
④要确定一定的离子强度。
5、 洗脱速度
洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。
二、凝胶过滤层析
1、 原理:
在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中,蛋白质的分子颗粒越大,受到凝胶颗粒的排阻越大,下行越快,优先洗脱出来;分子颗粒越小受到的排阻越小,阻力越大,洗脱出来的速度越慢。
2、 常用凝胶:
⑴天然凝胶:
琼脂糖凝胶
(2)人工合成凝胶:
葡聚糖凝胶(其商品名称Sephadex),有G-25,G-75,G-100,G-200等型号的凝胶。
其中G后面的数据为得水值,即每g干胶吸水毫升再乘以10.不同规格的凝胶性质不同,常用G-25脱盐。
3、应用:
(1)分离、纯化与鉴定;
(2)测定相对分子质量;
三亲和层析
1、 原理:
利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。
2、 应用:
酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。
四吸附层析
1、 原理:
利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离,取决于物质的分子结构。
2、 分类:
⑴物理吸附,如:
活性炭;⑵化学吸附,如:
氧化铝;⑶交换吸附,如:
硅胶。
电泳原理与技术
目前常用的电泳系统为区带电泳。
任何电泳技术方法,均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道,常见凝胶电泳的支持介质有
(1)聚丙烯酰胺凝胶
(2)琼脂糖凝胶(3)淀粉凝胶。
一聚丙烯酰胺凝胶电泳
(一)PAGE技术流程简介
1.组架(玻板、胶条、U型玻板、封胶)2.制胶(分离胶溶液、浓缩胶
溶液、插入梳子)3.点样4.电泳
5.染色6.脱色7.分析
(二) 丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构
1、 聚合原理:
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是用丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙烯在催化剂的作用下聚合而成。
通常采用过硫酸铉或核黄素来引发该过程,以N,N,N,,N'-四甲基乙二胺为增速剂。
该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。
聚合好的凝胶是立体网状结构。
2、 凝胶浓度和蛋白质分子量的关系
凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关,凝胶的浓度越小,其网眼越大,胶的浓度越大网眼越小。
分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶,而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。
(三) 影响凝胶聚合速度主要因素
1、 引发剂和增速剂的浓度:
浓度小易导致聚合速度慢;浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。
2、 系统pH值酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最佳pH值,以获得最佳的聚合结果。
3、 温度低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性;
4、 分子氧:
分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合;抽气。
5、 系统纯度:
金属离子会影响凝胶的聚合;
(四)PAGE分离蛋白质原理
PAG系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率,因为该系统工作状态下存在三种效应。
1浓缩效应 指样品在进入分离胶之前被浓缩成一条细线的现象。
(1)
在电泳系统中有含甘氨酸的Tris-HCI(pH8.5)
--电极缓冲液,浓缩胶pH6.5,通电后样品中的各种带负电荷的蛋白质会在快离子(CI)和慢离子(0.1%Gly)形成的高压带
之间初步分开并形成很窄的条带,而使整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线,即被浓缩之效果。
(2)蛋白质样品从网眼较大的浓缩胶进入网眼较小的分离胶时遇到的阻力突然变大。
2.电荷效应在设置好的浓缩胶及分离胶特定pH条件下,不同蛋白质所带电荷多少不同,并在稳定的静电场中向异极泳动的动力所决定的泳动速度不同,最终会被分离。
3.分子筛效应分离胶内属于立体的网状结构,分子量较大的蛋白质颗粒向异极泳动受到的阻力较大,泳动较慢,而分子量较小的蛋白质则阻力较小,向异极泳动较快,最终被分开。
(五)影响蛋白质泳动速度及分离效果主要因素
1.系统的pH值
凝胶体系及电极缓冲液的pH决定样品中蛋白质的带电性质,直接影响蛋白质的电泳方向和泳动速度。
pH一般设置成大于样品中蛋白质的等电点,蛋白质均荷负电,电泳方向朝阳极。
而当pH小于样品中蛋白质的等电点时,则所有蛋白质分子荷正电,静电场中向阴极泳动。
前一种电泳系统属于碱性电泳,后者成为酸性电泳。
2.电场强度
普通电泳5~20V/cm电压降(电位梯度)。
高压电泳70~00V/cm电压降(电位梯度)。
3.温度
电泳过程中由于电流作用致使凝胶发热,热效应对电泳有很大影响o温度升高时介质粘度下降,分子热运动加剧,自由扩散变快,有效迁移率增加,但对于蛋白质分离不利。
另外较高温度会使凝胶变形,分子筛效应降低,影响分离。
因此,一般要求在15-25°C之间进行电泳效果较好。
4.电渗作用
电泳介质或支持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子,使溶液相对带电,进而在电场作用下,溶液就会向一定方向移动,这种想象称为电渗现象。
带电溶液的移动会影响蛋白质的泳动。
二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE:
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
(一)SDS-PAGE分离基本原理
SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质
分子的二级、三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇、B-筑基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质-SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量,消除了不同分子间的电荷差异;同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同,这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。
因此,SDS-PAGE过程中蛋白质分子在凝胶中的泳动速度主要取决与亚基的分子量大小。
与PAGE技术方法相似,蛋白质亚基在电泳过程中存在三效应。
(二)未知蛋白质分子量的测定
以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电
泳迁移率,制作标准校正曲线,然后对未知蛋白在相同条件下进行
SDS-PAGE电泳,测定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量;
蛋白质含量测定方法简介
离心技术
一、 概念、用途、设备和基本操作
1.概念:
iWi心技术是利用iWi心机旋转时产生的强大iWi心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。
2.用途:
分离细胞器、大分子物质;固、液相分离;测定某些纯物质的性质。
3.设备:
离心机4.
基本操作:
(1)将待分离的物质悬浮于一定的介质中,装入离心管;
(2)精确平衡之后,对称放置于转头的插孔中;
(3)当转头旋转时,各种物质粒子在离心力作用下因各自大小、形状和密度的差异而以不同速度沉降,一段时间后,即被分离。
二、 离心(centrifugation)分离的基本原理1.粒子的沉降速度
(其中:
t:
沉降时间 邛:
悬浮介质的黏度rp:
颗粒半径 Pp:
颗粒密
度P:
介质密度rt:
旋转中心到液面的距离rb:
旋转中心到管底的距离-角速度)
由公式可知,在一定离心场中,颗粒的沉降速度不仅与离心力有关,而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。
一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密度和颗粒大小而分离。
2.相对离心力(relativecentrifugalfoceRCF)
(1)离心场产生的离心力的表示:
①习惯使用法:
转速:
如~转/分(r/min)缺点:
如果旋转半径不同,则粒子所受的离心力不同②标准法:
相对离心力(RCF)表示方法:
数字Xg如:
10000Xg
(2)相对离心力与转速的换算
计算法RCF=1.119E-5X(r/min)2Xr(Xg)
图表法根据旋转半径(r)、RCF、r/min的列线计算图进行换算
三、离心机(centrifuge)
1.制备离心机
2.分析离心机:
属于超速离心机,具有光学观测系统。
1分类:
水平转头、角式转头和垂直管转头
2注意事项
各种转头的离心管腔的大小、形状均有许多规格,以适应各种转速、样品量、分离目的、分离方法。
需要注意:
(1)每个转头都有一定的使用限度(次数,运转时间)。
超过限度使用,其最大额定速度应降低10%;二次超限使用,再降10%;每个转头必须单独建挡,记录使用次数和最大速度下的使用时间。
(2)转头上标定的最大额定转速是有条件的。
五、常用离心技术
1.沉淀离心
选定一定的时间、速度进行离心,使样品液中的大的固型物与液体分离,从而获得沉淀或上清夜。
又称为固液分离法。
使用普通离心机
2.差速分级离心
在均匀介质中,利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。
3.区带离心法
原理:
利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差异,当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降,不同粒子处于不同位置,则得到了分离。
分类:
(1)差速区带离心法:
根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分层。
(2)等密度区带离心法:
根据微粒的不同密度而分层。
密度梯度材料:
①要求:
无毒;合理的密度范围;易于颗粒分开。
②类型:
糖类(蔗糖)、无机盐(氯化车色)、硅溶胶(Ludox)、有机碘化物
沉淀技术
一、概述
1、 定义:
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使某溶质在溶液中的溶解度降低,从溶液中沉淀析出,而与其他溶质分离的技术过程。
沉淀分离是生化物质的分离纯化过程中经常采用的方法。
2.原理:
生化产品的分离制备技术都是根据混合物中的不同组份分配律的差别,把它们分配于两个或几个物相中(如有机溶剂抽提、盐析、结晶等)。
或者将混合物置于某一相(大多数是液相)中,外加一定作用力,使多组份分配在不同区域,从而达到分离的目的(如电泳、超离心、超滤等)。
除了一些小分子,如氨基酸、脂肪酸、某些维生素及胆固醇类外,几乎所有生物大分子都不能融化,也不能蒸发,只限于分配在固相或液相中,并在两项中相
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