一株吡嘧磺隆降解菌的分离鉴定及生物学特性.docx
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一株吡嘧磺隆降解菌的分离鉴定及生物学特性
一株吡嘧磺隆降解菌S8-1的分离鉴定及生物学特性
摘要:
以多年连续施用吡嘧磺隆除草剂的水稻试验田泥土为材料,采用富集培养、平板反复划线分离方法,分离到一株能以吡嘧磺隆为唯一碳源和能源生长的光合细菌(PhotosyntheticBacte-rium,简称PSB),命名为S8-1。
通过菌落形态特征观察、菌体形态学观察、活细胞吸收光谱特征、培养特性、生理生化特性及16SrRNA同源性序列分析(GenBank登录号:
GQ180069)等试验,初步鉴定该菌为红假单胞菌属(Rhodopseudomonassp.)。
利用高效液相色谱(HPLC)测定了菌株S8-1的降解性能,得出该菌降解吡嘧磺隆的最佳条件为:
pH值为7.0−7.5,温度为30°C−35°C;在30°C与pH7.0的光合细菌培养基中培养7d,对100mg/L的吡嘧磺隆降解率为52.07%;并且该菌对浓度高达800mg/L的吡嘧磺隆仍保持降解活性,外加发酵提取物能够明显提高菌体的生长及其降解效率,显示了该菌在高浓度农药废水处理及土壤农药残留生物修复方面潜在的开发价值。
关键词:
吡嘧磺隆,富集培养,光合细菌,红假单胞菌属
Isolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofa
Pyrazosulfuron-ethylDegradingBacteriumStrainS8-1
Abstract:
Astrainofphotosyntheticbacteriumcapableofdegradingtheherbicidepyrazosulfu-
ron-ethyl,designatedasS
8-1
wasisolatedandpurifiedfromthericeexperimentalfieldsoilsampleswhich
havebeensuccessivelyusedpyrazosulfuron-ethylformanyyearsbycontinuousenrichmentculturetech-
niques.Theisolateexhibitedsubstantialgrowthinmineralsaltmediumamendedwithpyrazosulfu-
ron-ethylasasolesourceofcarbonandenergy.Basedonthecolonyandcellmorphologicalobservation,
absorptionspectraoflivingcells,culturalandbiochemicalcharacteristics,andthesequenceanalysisof
thepartial16SrRNAgene,theisolateS
8-1
hadbeenpreliminaryidentifiedasRhodopseudomonassp..
Highperformanceliquidchromatography(HPLC)dataanalysisrevealedtheoptimumdegradationcondi-
tionsofstrainS
8-1
were:
pHvalueat7.0−7.5andtemperatureat30°C−35°C,respectively.Atthecon-尹乐斌等:
一株吡嘧磺隆降解菌S
8-1
的分离鉴定及生物学特性1433
centrationof100mg/L,52.07%ofpyrazosulfuron-ethylwasdegradedin7daysatpH7.0,30°Cand
7500lxoflightilluminationintensity.ThestrainS
8-1
stillmaintaineddegradationactivityattheconcen-
trationofpyrazosulfuron-ethylupto800mg/L,additionalyeastextractcansignificantlyincreasethe
growthspeedanddegradationrate.TheresultindicatedthatstrainS
8-1
haspotentialvalueforbiodegrada-
tionofpyrazosulfuron-ethylplantwastewaterorcontaminatedsoilsandwaters.
Keywords:
Pyrazosulfuron-ethyl,Enrichmentculturetechnique,Photosyntheticbacterium,Rhodop-
seudomonassp.
磺酰脲类除草剂是目前世界上最大的一类除草
剂,其除草机理为抑制乙酰乳酸合成酶(ALS),阻碍
细胞分裂而达到杀草目的
[1]
。
随着该类除草剂使用
量及范围的加大,其在作物中的残留以及对人类健
康和环境造成的毒害也越来越为人们所关注
[2]
。
吡
嘧磺隆(Pyrazosulfuron-ethyl)属磺酰脲类高活性内
吸选择性除草剂,药剂主要通过植物的根系被吸收
并在植物体内迅速进行传导,用于防治水稻田一年
生和多年生阔叶杂草和莎草科杂草,以提高作物产
量。
近年来随着吡嘧磺隆在水稻直播田的广泛应用,
药害问题也在不断发生,不同品种水稻的耐药性有
差异,早稻品种对其安全性好,晚稻品种(粳、糯
稻)对其相对敏感
[3]
。
因此,研究解决吡嘧磺隆残留
毒害问题对扩大该药剂在稻田生产中的应用,减
少对后茬作物及环境造成的污染具有重要的理论
和实践意义。
研究表明,微生物降解是除草剂从土壤中消失
的重要因素,目前分离得到能够降解磺酰脲类的微
生物主要有浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)
[4−6]
、
青霉菌属(Penicilliumsp.)
[4,7]
、放线菌属
(Actinomycetes)
[8]
、黄单胞菌属(Xanthomonassp.)
[9]
、
睾丸酮丛毛假单胞菌(Comamonassp.)
[10]
、假单胞菌
(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)
[11−14]
等。
然而,
关于光合细菌降解吡嘧磺隆还未见报道,笔者从多
年施用吡嘧磺隆的水稻直播试验田分离筛选出能够
降解吡嘧磺隆的光合细菌,并对吡嘧磺隆的降解特
性进行了初步研究,不仅丰富了微生物降解菌资源,
还可为生产上利用该菌株对吡嘧磺隆除草剂污染土
壤的原位生物修复提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1土壤样品及供试农药:
采自长期施用吡嘧磺
隆除草剂的湖南省植物保护研究所水稻直播试验田
的土壤样品。
100mg/L吡嘧磺隆标样储备液(农业
部环境保护科研监测所研制,天津市)。
97%吡嘧磺
隆原药(江苏常隆化工有限公司)。
吡嘧磺隆残留检
测由湖南省植物保护研究所农药残留检测室完成
检测。
1.1.2供试培养基:
PSB液体富集培养基的配制具
体参照文献[15]的方法;PSB分离纯化培养基为在
RCVBN培养基
[16]
中分别加入1.3%和1.8%的琼脂;
唯一碳氮源培养基为MSM培养基。
生理生化试
验所用培养基配方参照文献[17−18]。
除特别说明
外,所有的培养基pH值为7.0左右,1×10
5
Pa灭菌
30min。
1.2试验方法
1.2.1菌株S
8-1
的富集、驯化培养:
取适量的土壤
样品置于120mL的PSB液体富集培养基的培养瓶
中,加入吡嘧磺隆使其终浓度为100mg/L,在温度
为30°C、光照强度为7500lx的智能人工气候箱中
富集培养1−2周,光照培养期间每天手动摇匀3−5
次,可以观察到光合细菌在瓶壁上聚集,培养基也
变成红棕色。
然后取2mL培养液转接至新鲜的富集
培养基中,加入吡嘧磺隆使其终浓度为200mg/L,
同等条件下培养至培养液变棕红。
依照前面的方法
连续富集、驯化培养10代,吡嘧磺隆的浓度也渐渐
提高到1000mg/L。
1.2.2菌株S
8-1
分离及纯化:
参照孙军德等
[19]
的方
法并稍加改进,利用双层平板夹心法对富集、驯化
的菌体培养液进行分离纯化。
在直径为9.5cm的培
养皿中加入含200mg/L吡嘧磺隆的1.3%PSB分离
培养基,待其凝固后富集菌液用接种环划线,待水
汽稍干后再加入含同样浓度农药的1.8%PSB分离
培养基,用封口膜封好培养皿,置于上述同等条件
的光照培养箱中培养1周左右,用灭菌的牙签挑取
双层平板夹心层的单菌落于PSB液体培养基中光照
扩大培养,用同样的方法反复分离纯化3−5次,直1434微生物学通报2010,Vol.37,No.10
至获得纯培养物并保存,单菌落培养物编号为S
8-1
。
1.2.3菌株S
8-1
的鉴定:
(1)传统的细菌菌落形态、
菌体形态及生理生化鉴定:
以双层平板夹心层上
生长的菌落形态描述菌落颜色、大小和形状。
菌体
形态用光学显微镜(BX51,OLYPUS)与电子显微镜
(JEXL−230,日本电子公司)观察相结合。
革兰氏染
色方法参照文献[20]。
菌体的其它形态特征、培养
特性及生理生化试验参照文献[17−18,21]选择相
应试验,并结合《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)
[22]
进行菌种鉴定。
(2)菌株S
8-1
活细胞吸收光谱的测
定:
取2mL培养6d的菌液纯培养物在8000r/min离
心10min收集菌体沉淀,用灭菌的生理盐水洗涤菌
体沉淀3次,沉淀最后悬浮于60%的蔗糖溶液至原体
积,以60%的蔗糖溶液做参比,用北京普析Tu-901
型双光束紫外可见分光光度计检测菌体的活细胞吸
收光谱,扫描波长范围为300nm−900nm。
(3)菌株
S
8-1
的16SrRNA序列测定:
菌体基因组DNA的提取
采用上海生工生物工程技术服务有限公司的
UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒,具体方法参
照说明书。
以所提取的细菌总DNA为模板,在
Eppendorf公司MastercyclergradientPCR仪上进行
16SrRNA序列扩增,所用引物为原核生物16S
rRNA通用引物(8F:
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA
G-3′;1492R:
5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)
[23]
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PCR反应体系(50μL):
10×PCRBuffer(Mg
2+
plus)
5μL,dNTPs(各2.5mmol/L)4μL,8F/1492R引物
各1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,ddH
2
O37.75μL,
模板DNA1μL。
PCR反应程序为:
94°C5min;94°C
1min,50°C1min,72°C1min,34个循环;72°C10
min。
用BioDevGelExtractionSystemB试剂盒进行
胶回收,回收纯化后的产物送上海生工生物工程技
术服务有限公司完成测序。
(4)菌株S
8-1
16SrRNA
序列同源性比对及系统发育树构建:
将获得的16S
rRNA序列的测序结果在NCBI中进行BLAST同源
性比对检索,选出序列相似性大于96%的部分登录
号,应用MEGA4.0软件构建系统发育树。
1.2.4菌株S
8-1
的最适生长条件研究:
不同培养条
件对菌株S
8-1
生长的影响,主要的影响因素包括不
同的温度、pH值、光照强度及吡嘧磺隆浓度。
1.2.5菌株S
8-1
的降解能力检测:
(1)样品的前处
理:
样品的前处理参照文献[24−26],并稍加改进。
将菌液充分摇匀,取1mL菌液,用流动相定容到
10mL,超声波萃取处理20min,通过C
18
柱固相萃
取柱净化后,以3种不同比例的丙酮和正己烷混合
剂分3步洗脱,氮气吹干,5mL乙腈溶解,过
0.22μm有机滤膜,供HPLC测定。
(2)高效液相色
谱条件:
流动相(经过优化后的配比):
乙腈/水(用磷
酸调节pH值3.0)=70:
30(V/V);流速:
1mL/min;
柱温:
30°C;进样量:
10μL;检测波长为241nm。
(3)菌株S
8-1
对吡嘧磺隆降解率的测定:
吡嘧磺隆
降解率的计算公式为:
吡嘧磺隆降解率(%)=
(CK−CS)/CK×100%。
其中CS降解菌处理后的吡
嘧磺隆浓度(mg/L);CK为空白培养基中吡嘧磺隆浓
度(mg/L)。
2结果与讨论
2.1菌株的鉴定
2.1.1菌落形态及生理生化特征:
经过反复富集培
养和双层平板夹心法纯化分离,分离获得形态不同
的纯化菌株15株。
利用吡嘧磺隆除草剂作为唯一碳
源进行加压选择,选择单菌落直径大即繁殖速度
快、抗性较好的1个菌株作为目标菌株命名为S
8-1
。
S
8-1
在PSB双层平板(含100mg/L吡嘧磺隆)培养基
上,30°C、7500lx光照厌氧培养,7d后形成红色
的圆形铁饼状和点状菌落,菌落湿润且正反面颜
色一致,边缘整齐光滑且颜色较中间稍浅,有光
泽,中间稍稍隆起(图1),菌落直径0.54mm−
3.40mm。
光学显微镜下观察,革兰氏阴性,单细胞
呈小球形或卵状,有时细胞呈珠状串联,能在厌氧
或好氧条件下生长。
该菌超薄切片电镜观察表明:
菌体切片形态多变,以短杆形为主。
以二分分裂繁
殖,极生鞭毛(图2),菌体大小(0.7−1.2)μm×
(0.8−2.5)μm(图3),光合内膜结构为片层状,位于
质膜之下并与质膜平行(图4)。
菌株的生理生化特
征见表1。
2.1.2菌株S
8-1
的培养特征:
富集培养时,培养液
呈深褐色,培养瓶壁上有深红色的菌体附着物。
纯
化后菌株在光照厌氧或黑暗好氧及微好氧条件下均
能够生长,光照厌氧液体培养液开始变浑浊,随后
培养液为淡红黄色,对数生长期之后培养液变为鲜
红色或深棕红色,培养时间过长,培养瓶底部可见
菌体聚集成絮状沉淀。
若培养的温度或光照强度过
高,菌体过度代谢而死亡,培养液变黑发臭。
尹乐斌等:
一株吡嘧磺隆降解菌S
8-1
的分离鉴定及生物学特性1435
表1菌株S
8-1
的生理生化特性
Table1BiologicalandphysiologicalcharacteristicsofstrainS
8-1
CharacteristicsResultsCharacteristicsResultsCharacteristicsResults
Gramstain−3%NaCl−Aerobicdarkgrowth+
Motility+M.Rreaction−Succinateutilization+
Hydrogensulfide+Citrateutilization+Mannitolutilization+
V-Preaction−Acidfromcarbohydrates−Glycerolutilization+
Gelatinliquefaction+Indoleproduction−Pyruvateutilization+
Catalase+Urease−Benzoateutilization−
Oxidase+Pigmentproduction+Ammoniautilization+
Strachhydrolysis+Nitratereduction+Glucoseutilization+
Note:
+:
Positive;−:
Negative.
图1S
8-1
在双层琼脂上的菌落形态(培养7d)
Fig.1ThesinglecolonymorphologyofS
8-1
indouble-agar
plate(Culturedfor7d)
图2S
8-1
极生鞭毛电镜照片(×6000)
Fig.2Scannerelectronphotographofpolarflagellumof
S
8-1
(×6000)
2.1.3菌株S
8-1
活细胞光谱扫描:
菌株S
8-1
的活细
胞经过紫外分光光度计连续扫描,其色素吸收峰
如图5所示,在波长379nm、592nm、805nm及
862nm处均出现最大吸收峰,表明菌株S
8-1
含有红
螺菌目叶绿素a的吸收峰;在波长460nm、492nm
图3S
8-1
示细胞切面形态电镜照片(×40000)
Fig.3CellSectionmorphologyofS
8-1
byEM(×40000)
图4S
8-1
电镜照片,示光合内膜系统(×120000)
Fig.4InternalphotosyntheticmembranesofstrainS
8-1
by
EM(×120000)
和528nm则出现3个特征吸收峰,表明有正常红螺
菌黄质系的类胡萝卜素存在,这与《伯杰氏细菌鉴
定手册》(第8版)
[22]
所描述的相吻合。
由此可见:
菌
株S
8-1
活细胞含有光合作用所必需的细菌叶绿素a
及类胡萝卜素。
1436微生物学通报2010,Vol.37,No.10
图5菌株S
8-1
活细胞吸收光谱
Fig.5TheabsorptionspectraoflivingcellsofstrainS
8-1
2.1.416SrRNA序列同源性及其系统发育树分析:
测得的16SrRNA序列长度为1424bp,其在
GenBank中的登录号为:
GQ180069。
BLAST比对结
果与登录号为GU247218的Rhodopseudomonassp.
enrichmentculturecloneCS416SrRNA序列相似性
水平达97%,从中选取20株与S
8-1
16SrRNA序列
相似度高的菌株进行系统发育分析(图6)。
综合菌
体的形态学、生理生化及培养特性、活细胞吸收
光谱及16SrRNA序列同源性分析结果,结合《常
见细菌鉴定手册》
[21]
和《伯杰氏细菌鉴定手册》(第
8版)
[22]
中对光合细菌各种属的检索步骤及特征描
述,可初步确定分离的菌株S
8-1
为红假单胞菌属
(Rhodopseudomonassp.)。
2.1.5菌株S
8-1
的最适生长条件:
从图7可以看出,
S
8-1
在30°C生长良好,温度过高或过低都不利于它
的生长;35°C时,S
8-1
初期生长速度快但是很快进入
死亡阶段,并产生沉淀;如果温度过高,菌体代谢
过度旺盛或死亡,培养基变黑发臭。
S
8-1
在较广的
pH值范围内都能生长,其最适宜的pH为7.0,pH过
低或过高生长都受到抑制(图8)。
从图9可以看出,在
一定的时间条件下,随着光照强度的增加,S
8-1
的
数量不断增加,在20%光照强度(大约为680lx)时,
光合细菌的生长量最低,直到80%光照强度(大约
为7500lx)时,S
8-1
的生长趋于平稳,说明光照强度
对S
8-1
的生长有促进作用,这与李朝霞
[27]
等的研究
一致;但从节约能源的角度考虑,实际应用中只能
适当的提高光照强度,尽量达到最佳光照条件。
S
8-1
在含低浓度的吡嘧磺隆中的生长明显快于高浓度
条件下(图10)。
另外,在培养的过程中适当增加搅
拌对S
8-1
的生长有促进作用,可能是在搅拌的条件
下细胞在培养液中的分布更加均匀而促进了细胞
的代谢。
图6基于16SrRNA基因序列构建的菌株S
8-1
和相关菌株的系统发育树
Fig.6Phylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequenceofstrainS
8-1
andrelatedspeciesconstructedwithNeigh-
bour-joiningmethod
Note:
Numbersateachbranchpointsindicatethepercentagesupportedbybootstrapbasedon1000replicates.TheGenBankaccessionnum-
berisshowedinparentheses.Bar:
0.001substitutionspernucleotide.尹乐斌等:
一株吡嘧磺隆降解菌S
8-1
的分离鉴定及生物学特性1437
图7温度对菌株S
8-1
生长的影响
Fig.7Theeffectofinitialtemperatureonthegrowthof
strainS
8-1
图8pH对菌株S
8-1
生长的影响
Fig.8Theeffectofinitial
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