分子生物学实验步骤总结超全.docx

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分子生物学实验步骤总结超全

分子生物学实验步骤总结超全

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ﻩ

一目的基因的获得

细菌基因组DNA的提取

（1）仪器

1）台式高速离心机

2）恒温水浴箱

3）枪式移液器

4）灭菌的EP管和Tip头

（2）试剂

1）溶液1:

25%　　　　　蔗糖

　50ｍmoｌ／L　Trｉs-Hcl,ｐH8.０

　50mmol/Ｌ　　　　EＤTA,ｐH8．０

　5０0ug／ml　　　　　溶菌酶（现用现配）

　　　1０0ug/ml　　　RNaｓe

２）溶液Ⅱ:

１00mｍｏl/L　　　　Trｉs-Hcl,pＨ8.０

　　　1%　　　　SDS

　　　　　　４00ug／ml　　　　蛋白酶K

3）酚:

氯仿:

异戊醇（25:

2４:

1）

4）氯仿:

异戊醇（24：

１）

5）3moｌ/L　NaＡｃ（pH5.2）

6）异丙醇或无水乙醇

7）70％乙醇

８）　TＥ缓冲液：

　10mmol/Ｌ　　Ｔris-Hｃl，pH８.０

　　　　1mmol/L　EDTＡ，pH８．0

（3）实验步骤

1）5ｍL细菌过夜培养,5000ｒｐm离心10分钟，去上清液。

2）将菌体细胞悬于250uL溶液１中，3７°C水浴保温过夜。

3）加250ｕＬ溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。

4）加0.9倍体积的酚／氯仿／异戊醇（25:

24：

1），轻轻混匀，于1４０00rpm离心１0分钟，转移水相至新的Ｅp管，重复步骤4一次。

5）向转移的水相中加入0,９倍体积的氯仿/异戊醇（2４:

1），轻轻混匀,于１４00０rpm离心1０分钟,转移水相至新的Ep管,重复步骤5一次。

6）向转移的水相中加入０．1倍体积的3ｍol/ＬNaAｃ和0.7倍体积的异丙醇（或2．5倍体积的无水乙醇）,冰上放置３0分钟。

7）１4000rpm离心20分钟,弃上清，用0.5ｍL70％乙醇洗涤沉淀一次,弃上清，沉淀于室温干燥。

8）将DＮＡ沉淀溶解于１5uｌTＥ缓冲液中,－20°C保存。

9）进行ＤNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

植物DNA的SDS提取法:

（一）试验试剂：

1）研磨缓冲液：

称取５９.6３gNaCｌ，13.２5g柠檬酸三钠，37．２gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用０.2mｏl/Ｌ的NａＯＨ调至ｐＨ7．0,并定容至1000mｌ。

２）１0ＳＳＣ溶液：

称取８7．66gＮaＣl和4４．1２ｇ柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3）１SSC溶液:

用10SSC溶液稀释10倍。

4）0．1　ＳSC溶液：

用1ＳSC溶液稀释1０倍。

5）Rnase溶液:

用0.1４mol／ＬＮaCl　溶液配制成25mg/mｌ的酶液，用1mol/LHCl，ｐＨ至5.０,使用前经80℃水浴处理5ｍｉn（以破坏可能存在的Dｎasｅ）。

6）氯仿－异戊醇：

按24ｍl　氯仿和1ml异戊醇混合。

7）5mｏl／L高氯酸钠溶液：

称取ＮaClO4．H2O７0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至10０ｍl。

8）ＳDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：

将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70～80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用。

9）　1mol/LHCl。

10）　０.２mol/LNａOH。

1１）二苯胺乙醛试剂：

1.5ｇ二苯胺溶于10０ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处,使用时加0.１mｌ　乙醛液[浓乙醛：

H2Ｏ=１：

５0（V／V）］。

１２）1.０ｍol／L高酸溶液（HClO4）。

１3）0.05mｏｌ／ＬＮaOH。

１4）DＮA标准液:

取标准DＮA25mｇ溶于少量0.05mｏl/ＬNaOH中，再用0．05mol/LＮaOH定容至２5ｍｌ,后用移溶管吸取此液5ｍl至50ｍｌ容量瓶中,加5．0ml１mol／LＨＣlO4，混合冷却后用0.5ｍol／ＬHClＯ4定容至刻度，则得100μｇ/ｍl的标准溶液。

（二）实验步骤:

1）称取植物幼嫩组织10ｇ剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2）将匀浆无损转入25mｌ刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，加上塞子,剧烈振荡3０ｓ,转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。

以4000ｒpm离心５min。

3）离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4）将试管置72℃水浴中保温3min（不超过４mｉn），以灭活组织的ＤNA酶,然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温,加５mｏl/L高氯酸钠溶液［提取液：

高氯酸钠溶液＝4：

1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为１mol/Ｌ。

5）　再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中，振荡1miｎ,静置后在室温下离心（400０rpm）5ｍｉn，取上清液置小烧杯中。

６）用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。

此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7）然后加入0.5ｍl　左右的1０ＳSC，使最终浓度为1SSC。

8）重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9）　加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为5０~70μg/ml，并在３7℃水浴中保温３0min,以除去RNA。

１0）加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡１min，再除去残留蛋白质及所加Rnａｓe蛋白,室温下以４00０rpm离心5min,收集上层水溶液。

11）　再按６、7步骤处理即可得到纯化的ＤＮA液。

2、PCR扩增目的基因

（1）器材

1）微量移液器

2）灭菌的Tip头、ＰCR管

3）PCR扩增仪

4）　目的DNＡ（ＤNA模板）

5）dNＴP混合物

6）引物对

7）　Taｐ酶

8）PCR扩增试剂盒

（二）试剂

1）10×PCR缓冲液（含Trｉs-ＨCl100mmｏl/Ｌ;ＭgCｌ2　15mmol/Ｌ、KCl　500mmol/L,pH8．3,0．１%明胶）

2）脱氧核苷三磷酸dNＴPs：

配成10mＭ——dAＴP,ｄＴTP，dGＴP，dCTＰ各10mM,用NａOH溶液调节至ｐＨ８.3。

）　

3）氯仿-异戊醇:

配成24:

１的比例，室温避光保存。

4）酚：

氯仿：

异戊醇=25：

2４:

1

５）３MNaAｃ、ddH2O

6）无水乙醇:

7０%乙醇

７）TE缓冲液　

（三）实验步骤

１）在0.2mｌ薄壁反应管中加入下列成份:

（混匀）　

　ddH2O:

补至终体积（2５μl）　

1０×PCR缓冲液1/１0总体积

　２.0mＭdNTPs　1μl

　２Ｕ/μlTaｑ　DNA聚合酶0.５μl

引物混合液（１0pｍoｌ/μl/引物）１μl

DNA模板０.6μl

混匀后,在台式离心机上瞬时离心１0秒。

2）在设定好的PCＲ仪上反应

９5°C,5min;95°C，1miｎ;56°C,１min；72°C,2mｉn。

反应３０轮。

3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至４°C。

取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳（实验三）,确认是否有目的的PＣR产物。

如果PＣR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物,可以通过纯化得到改善。

纯化继续４）—6）。

４）转至1．5ml离心管，向管中加２5μl酚，2５μｌ氯仿－异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。

5）吸取上层液,转至另一已加5μl3MＮaAc的1.5mｌ的离心管，加150μl无水乙醇,-２0°C过夜。

6）离心10000rpm,1０分钟，弃上清,加0.5ml70％乙醇，１00００rpｍ离心,5分钟。

弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μlTE。

（四）技术要点

1）PＣR各组份的配制与加样量要特别注意。

（１）　引物浓度：

１0　ｐmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强,扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。

（2）引物的配制：

厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OＤ值,1OD约含33μg。

开盖前先将干粉离心至管底,加双蒸水至浓度２μg/μl，再取部分稀释至10pmoｌ　／μl。

　引物浓度计算公式:

1ｐｍol=（3．３×10-4μg）×ｎ　，n是引物的碱基数　

（3）Mg2＋：

使用浓度一般在１.５mM,要求模板不含高浓度EDＴA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg２+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。

（4）　模板ＤNA：

浓度不可过高，质粒DNA2０ｎg即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000－10000倍作为模板使用。

（5）Tａq　DNA聚合酶:

一般用量5U/100μl。

酶量过大易导致扩增非特异序列，Taｑ酶具有末端转移酶活性,常在3’端加A。

2）扩增轮数与退火温度

扩增轮数：

一般３0轮以内就可使模板扩增1０６倍，超过30轮，错配率升高。

退火温度计算公式：

Ｔm值=（GC×4+AT×2）–4　

3、琼脂糖凝胶电泳的检测

（一）仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tｉp头、水平电泳槽、电泳仪）

2）凝胶成像仪

（二）试剂及材料

目的DＮA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDＴA、EＢ、DNA纯化试剂

盒

　1）TＡE电泳缓冲液

浓储存液50×:

242gＴriｓ;57.１ml冰乙酸;10０ｍl0.5ｍol/Ｌ　EDTA（PH8.０）

定容至一升。

使用液1×:

4.８4gTrｉs；1.15ｍl冰乙酸；2ｍl0.5mｏｌ/LEDTA（PH8.0）

定容至一升。

2）样本液

１０×缓冲液:

60%蔗糖;0．４%溴酚蓝

（三）实验步骤

１）将有机玻璃内槽洗净、晾干,放置于水平制胶器中,插好梳子,在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。

2）0.8%琼脂凝胶板的配制：

取０.6g琼脂糖加8０mlTAE（1×），20ml水,微波炉加热融化３分钟,将其冷却至５5°C-６5°C,加入ＥＢ储存液1ul,小心混匀,缓慢倒入制胶槽中。

（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。

3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽，加入TＡE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。

４）ＤＮＡ样品按照１0:

1的比例加入样本液,在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。

同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。

5）接通电泳槽与电泳仪的电源,维持稳压1-5V/ｃm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断,当移动到距凝胶前沿1-2ｃm出停止电泳。

６）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。

（四）技术要点

1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定ＤNA的大小,小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在１%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与５00bp的双链线状ＤNA一致。

不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性ＤＮA大小范围见下表1。

表１不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）　

分离DＮA的有效范围（kb）　

0.3

60~5　

0．6

20~1

０.8　

10～０.8

１.0

7~0.5　

1．2

6~0.4　

1.5

３～0.2

２.0

２～０.1　

2）电泳中注意防止凝胶发热。

3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5Ｖ/cm（电极间的最小路径）。

随着电压的增加,琼脂

糖凝胶的有效分离范围缩小。

４）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。

四、目的DNA的回收纯化

（一）仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统

２）凝胶成像仪

3）离心机

4）单面刀片

5）恒温水浴锅

（二）试剂

１）　DＮＡ回收试剂盒

2）5０×TAE

3）ddＨ２O

（三）实验步骤

１）在紫外灯下切分含ＤNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.５ml离心管中。

2）按每1０0mｇ琼脂糖加入300—６00μl溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul）,置5５℃水浴10分钟,使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。

3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，1２000rｐｍ　室温离心1分钟,倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。

4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，１20０0rpｍ室温离心3０秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。

５）再在吸附柱中加入５０0uI漂洗液，1200０ｒpm室温离心15秒,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。

6）1２00０ｒｐm室温空离心1分钟。

７）将吸附柱放入一个干净的1．5ml的离心管中，在吸附膜中央加入３0ul洗脱缓冲液，室温静置２分钟后,12000rｐm室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ｍl离心管（DNＡ）贮存于－20℃。

五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组

（一）仪器及材料

1）回收得到的目的DNA

2）BamHI、　HiｎdIII、　T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒

3）ｐUＣ1８‐ＣAT质粒、双蒸水、１0×酶切通用缓冲液K

4）EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机

　　　　　　　　　表1常用酶切缓冲液配方

缓冲液名称

配方

贮存温度（℃）　

10×Ｌ　

1０0ｍMTriｓ-ＨＣl,ｐＨ7.５

１00ｍMMgCl２

10mＭDTT　

-20

１0×M

100ｍMTris-HＣｌ,pH７．5

100mMMgCｌ２

10mM　DＴT

500ｍMNaCｌ

-20　

１0×Ｈ

50０ｍMＴris-HCl,pH７.5

1０0mＭ　MgCl2

10ｍMDTT

1０0０mM　NaCl　

-２0

10×K

200　ｍMＴris-HCｌ,ｐＨ8.5

1００ｍMMgCl2

10mMDＴT

1０00mM　KＣl

-20

１0×T（BSＡ-Free）

３30ｍMTrｉｓ-Ａc,pH７.9

10０mＭＭgAｃ

5　ｍMDTT

660mＭKAc

－20　

0.1%　ＢSA　

－20

0.1％Triｔion　Ｘ-１００

-20

（二）实验步骤

１）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系:

酶切反应体系（20uｌ体系）

管号　　核酸　１0×酶切通用缓冲液K　ddH2ＯBａmHI　　ＨｉndＩII

1　　1５ul目的ＤＮA　2ｕl　　　　　　0uｌ　2ｕl　1ul

2１0uｌpUＣ18‐ＣAＴ质粒　　　2ul　　　5ul　　2ul　　1ul

2）37℃保温三小时。

3）酶切产物的纯化回收，每１00ul溶液加入700uｌ溶胶液,其余的操作步骤详见实验四

4）载体与目的DNA的连接。

在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）:

目的DNApUＣ18‐CAT质粒10×连接缓冲液　　Ｔ4　DＮA连接酶ddH2Ｏ

　Xuｌ　Ｙ　ul　　　２ul　　　　1ul　　　Ｚul

目的ＤNA和pUＣ18‐CAT质粒的相对浓度约为1：

3—1:

１0

5）１4℃水浴保温过夜。

6、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化

（1）仪器

1．小型高速离心机

2．恒温摇床

3．恒温培养箱

4．‐20℃冰箱

5．恒温水浴器

6．超净工作台

7．高压灭菌锅

（二）材料

1．氨苄青霉素

2.大肠杆菌DＨ5a

３.连接产物

4．离心管

5．枪头、微量移液器

６．试管、培养皿、三角瓶

（三）试剂

LB　培养基（根据需要确定配制的量）:

1０g/L胰蛋白胨，5ｇ/L酵母提取物，１0g/LNaCｌ,加水至1000ｍl，高压灭菌,保存在室温。

氨苄青霉素：

用去离子水配成10０mｇ/ml的储存液,过滤除菌,－20℃分装保存。

卡那霉素:

用去离子水配成10０ｍｇ/ml的储存液,过滤除菌，-2０℃分装保存

无抗生素LＢ琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）:

1０g/ｌ胰蛋白胨，５g／l酵母提取物，１0g/ｌNaCl,15ｇ／l琼脂粉，加水至100０mｌ，高压灭菌;铺平板,冷却后在37℃培养2４小时,保存在室温。

含有抗生素ＬＢ琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）:

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物,1０g/lNａCl,15ｇ/l琼脂粉,加水至１0００ｍl，高压灭菌;当培养基降温至５０℃左右，加入终浓度为１00μg/ml的氨苄青霉素或5０μｇ／ｍl卡那霉素，并铺平板,冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

0.１ＭCaCl2（根据需要确定配制的量）:

1１.099克溶解在１00０ml灭菌水中,0．２2μm滤器过滤除菌。

氯化钙分子量为：

1１0.99。

50%甘油:

５０ｍl甘油加入５0mｌ水,混匀，高压灭菌。

其他:

DH５α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干,接菌环,加250ｍlＬB液体培养基的１00０ml灭菌锥形瓶一个，灭菌5０ｍｌ和500ｍL离心管若干,灭菌刻度吸管若干,冰盒，移液器,灭菌移液器吸头，灭菌Eｐpendorf管等。

（四）实验步骤　

１）以接菌环从-70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；

2）挑取单菌落接种于5　mL无抗生素ＬB培养基中,37℃振荡培养过夜；　

３）按照1:

100接种菌液至2５0ｍＬLB培养基中，３７℃剧烈振荡培养1.5-2　小时左右，至ＯD600达0.4-０．6;　　

4）将菌液冰浴１0　分钟，转移至预冷的500mL离心管中，4℃,４000rｐm离心10分钟；　

5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于５0ｍL预冷的０．1ＭCaCl2中，冰浴２0　分钟，４℃，４０００rpm离心10　分钟;

6）弃尽上清。

以１２．5mＬ（菌液体积的5%）预冷的０．１MCａCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的５0%甘油水溶液,混匀后按每支5０μL在冰上分装，-80℃保存；

注:

以上操作全部在无菌条件下进行。

7）取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上;

8）从－80℃冰箱取３管感受态细菌（每管5０μl）,在冰上融化;

9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀,放置冰上2０－3０分钟；同时做两个对照管

•　受体菌对照:

50μl感受态细胞＋2μl无菌水

•质粒对照：

50μｌ０．1MCaＣl2溶液＋2μl连接产物

１0）42℃加热９0秒,迅速置于冰上1-2分钟；

11）每管加入400－1０0０μl的无抗生素液体ＬB培养基,在3７℃摇床缓慢摇荡20－6０分钟;　

12）用<10０00rpｍ离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μｌ并用移液器吹吸重悬细菌;

13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的ＬB琼脂糖平板上,倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。

（五）技术要点

１.加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％；

2．42℃热激时,必须要保证温度的准确性;

3.涂布LＢ平板的菌液量应该根据经验确定。

如果连接效率很高,而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加,甚至全部菌液涂布平板。

判断的标准：

在LＢ平板上生长密度合适的单菌落;

4．涂布平板之后，在３7℃培养的时间不超过12-１６小时，否则可能产生卫星菌落；　

5.防止其它质粒污染;　

６.防止其它细菌污染。

7、质粒DＮA的提取及重组子的鉴定

（1）仪器

1．恒温培养箱

2．恒温摇床

3．小型高速离心机

4．高压灭菌锅

5．分光光度计

（2）试剂及材料

1.转化重组子

２.缓冲液A:

５0mM葡萄糖;10mＭ　EDＴA;25mMTｒis-ＨCl，pH8．０。

3.碱溶液：

0.2M　NaＯH；　１%SDＳ,PH12.5。

4.乙酸缓冲液：

3ＭNａAC;2M乙酸,ｐH4.8（盐酸调ｐH）。

5．TE缓冲液:

10mＭTris-HCl，pＨ8．0；1mMＥDTA．。

６.ＲＮA酶Ａ溶液:

１０mg/mｌ　RNＡ酶Ａ,用TE配制,100°C煮１0分钟,灭活ＤNA酶。

缓慢冷却至室温,1０0００r/ｍin离心5ｍｉn,上清于－2０°C保存。

7.LB培养基:

10g胰蛋白胨,5g酵母粉,5gNaCｌ加水至1０00ml，用1MNaOＨ调pH至7.5，高压灭菌。

８．氨苄青霉素：

用去离子水配成1０0mg/ml的储存液，过滤除菌，-2０℃分装保存。

9.ＬA培养基：

在ＬB培养基中加入终浓度10０μｇ/ml的氨苄青霉素。

1０．异丙醇

11.酚－氯仿－异戊醇:

25:

２4：

1

１2．70%乙醇　

1３.3MNaＡc

（3）实验步骤

１）从转化平皿上挑一克隆接种到ＬＡ液体培养基中,３７℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—1．２时,收获细菌。

菌液转到1.5ｍlＥpｐeｎdｏrｆ管中,离心8000rpm，2分钟，弃上清。

2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。

3）加200μl碱溶液,裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮,开盖后能拉出丝状粘稠液体。

4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次,混匀,冰浴1０分钟。

5）离心10000rpm,5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。

6）加等体积的酚－ｌ氯仿-异戊醇（2５:

2４：

1）混匀，离心10０00rpm，1分钟。

７）吸上层水相至另一Eppendoｒf管中,加等体积的氯仿混匀，离心10000ｒpm,1分钟。

8）吸上层水相至另一Eppendｏｒf管中，加０．6倍体积的异丙醇,混匀，室温或-2０°C,10分钟。

９）离心100０0rｐm,１0分钟，弃上清,加入１ml　70％乙醇。

勿混匀,离心１00００rpm,5分钟,重复加入1mｌ70%乙醇一次,弃上清,干燥箱中干燥。

１0）干燥后,加入30μｌTE（含ＲNA酶A10ul,２0μg/ｍl），使质粒溶解，-20°C保存备用。

1１）取一个灭菌的ＥＰ管,依次加入下列试剂

10×限制酶缓冲液2.0uｌ、重组质粒5.0ul、ddH2O　11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为2０.０ｕl。

12）将上述试剂轻轻混匀,稍加离心，集中溶液，37°C水浴保温３—4小时。

酶切结束时,加入０.5mmｏl／LEDTA（PＨ8.0）使终浓度达10mｍol/L，以终止反应。

13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。

（四）技术要点

1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA,第一步需使菌体完全重悬。

2）加入碱溶液后,反复混匀使细菌充分裂解,但需要轻柔