石菖蒲挥发油含量测定.docx
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石菖蒲挥发油含量测定
南京中医药大学
本科生毕业论文
药学院药学专业08年级
学号:
642008315
学生:
钟笑
论文题目:
石菖蒲中β-细辛醚含量的测定
实习单位:
雷允上药业
指导教师:
钱坤
起止时间:
2012年01月04日至2012年06月08日
2012年5月25日
石菖蒲中β-细辛醚的含量测定
钟笑
摘要:
目的:
通过测定石菖蒲中主要成分β-细辛醚的含量,来建立石菖蒲含量标准,控制药品生产中石菖蒲的用量,从而到达生产出合格药品。
方法:
用HPLC法测定其有效成分β-细辛醚含量。
结果:
薄层鉴别中,石菖蒲供试品在与对照品相对保留时间相同的位置上,显相同颜色的斑点。
HPLC法测得β-细辛醚在20μg/ml-100μg/ml范围内线性关系良好,以进样量为X,峰面积为Y作回归方程,其回归方程为y=22807x-58829,r=0.9997,平均回收率为5%〔RSD=%〕。
结论:
该方法简便可行、重复性好,可用于石菖蒲的质量控制。
关键词:
石菖蒲;β-细辛醚;高效液相色谱;薄层色谱
TheStoneCalamusβ-asaroneContentDetermination
ZhongXiao
Abstract:
Objective:
tothedeterminationofmaincomponentsinRhizomaAcoribetaasaronecontent,toestablishthestonecalamuscontentstandards,controlofpharmaceuticalproductioninthestonecalamusdosage,soastoachievetheproductionofqualifiedmedicines.Methods:
usingtheHPLCmethodforthedeterminationofitseffectivecompositioncontentofbetaasarone.Result:
theTLC,Acoruscalamusforsampleandreferencesubstanceintherelativeretentiontimeonthesameplace,thesamecolorspots.HPLCmeasuredbybetaasaronein20-100μg/mlwithinagoodlinearrelationship,withsamplesizeX,peakareaforYregressionequation,theregressionequationisy=22807x-58829,r=0.9997,theaveragerecoveryratewas5%(RSD=%).Conclusion:
themethodissimpleandfeasible,withgoodreproducibility,canbeusedforthequalitycontrolofacorus.
Keywords:
calamus;betaasarone;highperformanceliquidchromatography;thin-layerchromatography
石菖蒲(Acorustatarinowiischott)系天南星科(Araceae)菖蒲属石菖蒲的干燥根茎,中国药典2010年版将其收载其中。
[1]石菖蒲为多年生草本,味辛、苦,性温,归心、肝、肺、脾、胃经,具有健胃祛风、活血止痛、开窍豁痰、醒神益智、消肿、解毒、杀虫之成效。
临床上常用于消化不良、热病神昏、癫狂、痰厥、胸腹胀满、胃肠绞痛、痈疖肿痛、跌打损伤等。
[2]近年来研究发现,挥发油是石菖蒲镇静、催眠、抗惊厥作用的主要有效部位,[3]而挥发油中主要活性成分是细辛醚系列物,主要有甲基丁香酚、顺式甲基异丁香酚、α-细辛醚、β-细辛醚等。
[4]
研究说明,不同产地石菖蒲药材既有较好的相似性,又存在一定差异。
通过对不同产地石菖蒲的挥发性成分和主要挥发性成分的分析结果可知,β-细辛醚、α-细辛醚、γ-细辛醚和顺式-甲基异丁香酚为石菖蒲的主要成分,可作为石菖蒲鉴别和质量评价的必要条件。
[5]
本文主要从石菖蒲药材中β-细辛醚含量进行研究,具体来说就是通过测定石菖蒲中主要成分β-细辛醚的含量,来建立石菖蒲含量标准,控制药品生产中石菖蒲的用量,从而到达质量标准。
常用的含量测定方法为GC-MS联用,虽然GC-MS联用的方法在定性分析方面具有很强的鉴别能力,但应用于定量分析时其选择性,重复性,灵敏度等均与高效液相色谱法有一定差距。
因此本次研究拟建立用高效液相色谱测定石菖蒲中β-细辛醚的含量的方法。
1.1仪器
岛津高效液相色谱仪〔主要部件:
LC-20AD双泵,Sil-20A自动进样系统,SPD-20A检测器,LCsolution色谱工作站。
〕
SK250HP型超声波清洗器。
〔KUDOS〕
XS105电子分析天平。
JFSD-100粉碎机。
具塞锥形瓶、容量瓶、移液管、胶头滴管、漏斗、滤纸、玻璃棒、量筒、烧杯、称量纸、培养皿。
甲醇为色谱试剂〔一级〕、水为重蒸水、β-细辛醚对照品、石菖蒲药材。
2.1.1来源
石菖蒲为天南星科石菖蒲〔Acorustatarinowiischott〕的干燥根茎。
2.1.2薄层鉴别
取石菖蒲药材,经粉碎机粉碎并研磨成粉,过筛,取石菖蒲粉末〔中粉〕0.5g,加乙酸乙酯10ml,浸泡1小时,低温超声处理〔功率250w,频率250kHz〕20min,滤过,滤液作为供试品溶液;取β-细辛醚对照品用乙酸乙酯配置成1ml含2mg的溶液作为对照品溶液。
取上述试液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚:
乙酸乙酯〔12:
1〕为展开剂,上行展开,待展开至前沿线时,取出薄层板,晾干,然后喷以5%磷钼酸乙醇溶液,吹热风至斑点显色清晰。
结果薄层鉴别中,石菖蒲供试品与β-细辛醚对照品相对位移时间相同的位置上,均成深蓝绿色斑点,见图1:
图1
2.2HPLC法测定石菖蒲中β-细辛醚含量
色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min;进样量:
10μL;按上述色谱条件,理论塔板数按β-细辛醚。
[6]
2.2.2石菖蒲药材供试品溶液的制备
μm微孔滤膜过滤,滤液即为供试品溶液。
精密称取β-细辛醚对照品适量,用甲醇配制成每1ml甲醇含β-细辛醚0.05mg的对照品溶液。
2.2.4线性关系考察
精密称取β-细辛醚对照品适量,用甲醇配制成20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml的β-细辛醚对照品溶液进行高效液相色谱测定,按色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min的色谱条件测定峰面积,以峰面积为Y对进样β-细辛醚浓度X进行线性回归,见表1,图2:
编号进样量/μlβ-细辛醚/μg*ml-1峰面积
11020408890
21040849554
310601296952
410801756336
5101002236187
表1
图2
得回归方程y=22807x-58829,r=0.9997。
实验说明:
β-细辛醚在20-100μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.5精密度试验
精密取上述对照品溶液,按色谱条件:
色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm重复进样6次,见表2:
编号进样量/μL峰面积平均值RSD
1102236187
2102257502
31022319682260204.70.697%
4102279875
5102265994
6102239698
表2
对照品β-细辛醚的峰面积的平均值为2260204.3,RSD为0.697%。
2.2.6稳定性试验
精密取上述供试品溶液,按色谱条件:
色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min;进样量:
10μL;分别在室温下放置0、2、4、6、8、10小时测定,见表3:
编号时间/h进样量/μL峰面积平均值RSD
1010826578
2210825466
3410822394822194.30.318%
4610820973
5810819959
61010817796
表3
结果供试品峰面积基本不变,RSD为0.318%,说明样品溶液在10h内基本稳定。
2.2.7重复性试验
按色谱条件:
色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min;进样量:
10μL,将同一样品平行做6份含量测定,并计算含量,见表4:
编号进样量/μL峰面积平均值RSD
110819657
210807769
310812597814707.50.577%
410809875
510823850
610814497
表4
结果,石菖蒲药材中β-细辛醚峰面积平均值为814707.5,平均含量为9.590mg/g,RSD为0.577%。
说明本方法有较好的重现性。
2.2.8加样回收率试验
精密称取已知含量的石菖蒲药材6份,按2.2.2供试品制备方法,8g,精密称定,置具塞锥形瓶中β-细辛醚μm微孔滤膜过滤,滤液即为供试品溶液。
在PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min的色谱条件下,进行含量测定,见表5:
编号称样量/mg样品含量/μg加入量/μg测定量/μg回收率平均回收率RSD
182.270.329130.82598.0%
278.480.314200.80999.4%
360.3260.4940.81999.9%99.85%%
440.302120.827101.6%
584.190.33770.849100.6%
681.330.3250.4890.81199.6%
表5
平均回收率为5%,RSD为%。
2.2.9样品含量测定
取石菖蒲药材3批,将石菖蒲药材经粉碎机粉碎,将石菖蒲粉末过筛,取
中粉约0.05g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,摇匀,称定
重量,浸泡2小时,超声处理〔功率250w,频率250kHz〕20min,放冷,再称
μm微孔滤膜过滤,
滤液即为供试品溶液。
在PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min色谱条件下进行含量测
定,见图3,图4,表6:
图3石菖蒲样品
图4β-细辛醚对照品
含量测定结果为
批号峰面积β-细辛醚/mg*g-1平均值/mg*g-1
120410
1201178254579.716
120305
表6
3.讨论
石菖蒲挥发油中β-细辛醚能明显降低动脉粥样硬化大鼠血脂,改善高黏血症大鼠的血液流变性,能降低心肌缺血大鼠异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠内皮素(ET)水平、提高NO的含量,降低心肌组织损伤程度和坏死率,显示了对心血管明显的保护作用。
[7]石菖蒲对豚鼠气管平滑肌具有解痉作用,其有效部位是总挥发油,有效成分主要有α-细辛醚、β-细辛醚等。
[8]石菖蒲镇静安神、抗惊厥的作用在中医治疗癫痫发作中广泛应用。
石菖蒲的总挥发油和水提液是中枢镇静作用的主要有效部位,而石菖蒲挥发油能明显延长士的宁所致惊厥小鼠的潜伏期,减少惊厥次数。
[9]大量实验说明,石菖蒲挥发油既具有兴奋、抗抑郁、抗缺氧作用,又具有镇静、催眠、抗惊厥作用,同时也有较好的益智、脑保护作用。
因此,在大规模生产中,可以考虑将石菖蒲挥发油代替石菖蒲药材。
3.2
石菖蒲根茎中的挥发油,含油率随产地不同差异较大,在0.5%-3.27%之间,挥发油的主要成分为α-细辛醚(0.705%-1.53%)和β-细辛醚(0.035%-0.258%)。
由于石菖蒲的含油率随产地不同差异较大,[10]采用不同地区产的石菖蒲可对实验结果产生影响,例如α-细辛醚、β-细辛醚在浙江金华和河南嵩县产石菖蒲中的含量较高。
可从β-细辛醚方面研究不同地区石菖蒲的差异。
本次试验中,本人所使用的对照品为β-细辛醚的纯油,而不是β-细辛醚粉末,在计算β-细辛醚重量时,是用β-细辛醚的体积与密度来换算的。
在此过程中往往会有误差的存在,会影响最后的实验结果。
如果此次试验中,β-细辛醚对照品是用粉末来配置,是否可以使结果更精确。
3.4
在石菖蒲挥发油中,不仅存在β-细辛醚,还存在α-细辛醚、γ-细辛醚和顺式-甲基异丁香酚等一系列有效成分。
而近年来研究发现β-细辛醚存在一定的毒性,长期服用会引起中毒,而α-细辛醚的含量较之又少,所以是否有工艺可以使β-细辛醚转化为α-细辛醚。
本文选用色谱柱:
PhenomenonexC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:
水:
甲醇(37:
63);检测波长253nm;流速:
1ml/min.β-细辛醚在15min左右出峰,并与其他成分能够到达基线别离。
本研究对石菖蒲挥发油中β-细辛醚的含量进行了测定,并对线性范围,精密度,稳定性,重复性,加样回收率分别进行了考察,结果说明该方法简便灵敏,准确可靠,回收率合格,可用于β-细辛醚的质量控制。
将药材用甲醇浸渍过夜,超声波处理不同时间提取,结果30min时含量较高,60min与30min基本一致,故确定超声处理时间为30min。
近年来已有不少石菖蒲水提液、去油煎剂等药理活性的报道,通过对其兴奋—镇静作用研究和抗抑郁作用的研究,提示其水提液与挥发油具有相反的药理活性,这正符合了石菖蒲具有镇静安神和醒脑开窍的双向作用。
但多年来药理实验着重研究其镇静抗惊作用,而对醒神开窍(兴奋)作用的研究以及其有效部位和作用机理的研究不足,因此应加强对其水溶性部份的有效部位和药理作用机理的研究,为临床合理用药提供依据。
此外鉴于石菖蒲既抗癌又致癌的矛盾性,有必要对其毒性作详细系统的研究,以便正确指导石菖蒲的临床应用。
此外,在中药药理、毒理实验中,经常采用的供试品是水煎浓缩液,汤剂在浓缩过程中成分的变化鲜见报道,挥发油含量较多的药材这一问题显得尤其突出,实验室自制的水煎浓缩液其药学品质与临床患者服用的汤剂存在的差异尚未有实验定论,导致中药实验研究与临床应用的脱离,对此应引起足够的重视。
[11]
参考文献
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中国医药科技出版社,2010.
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致谢
感谢苏州雷允上药业给我提供实习的时机,感谢钱坤老师对我论文撰写的指导,感谢学姐在论文撰写中的帮助,感谢雷允上中心化验室和技术部给予的帮助与支持,感谢校领导在论文撰写过程中的给予的意见与建议。
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