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组织培养
第1章实验室及基本操作
熟悉植物组织培养实验室及基本设备;熟练掌握无菌基本操作技术及培养基的配制;了解离体培养体系建立的影响因素。
第1节实验室及基本设备
一、实验室:
准备室、无菌室、培养室和温室。
1.准备室
(1)进行一些常规的实验操作;
(2)器具的清洗干燥和保存;(3)培养基的配制和灭菌;(4)蒸馏水的生产;(5)常规的生理生化分析等;(6)化学试剂和玻璃器皿的存放;
准备室常用的仪器和设备:
普通天平和分析天平;电冰箱;水浴锅;高压灭菌锅;蒸馏水制造装置;干燥箱;酸度计;微波炉和电炉等;
2.无菌操作室:
进行植物材料的消毒、接种以及培养物的继代转移操作的场所。
超净工作台的使用给接种带来了很大的方便。
超净工作台的种类:
根据风幕形成的方式可分为垂直式和水平式两种。
无菌操作室的维护:
定期消毒:
a.用甲醛和高锰酸钾产生的蒸汽熏蒸,每平方米空间大概需要2ml甲醛与过量的高锰酸钾。
b.或室内安装紫外灯,在接种前开灯20min左右进行杀菌。
注:
避免紫外灯照射
3.培养室
接种后的材料通常放在培养室中进行培养,使其生长分化.
Ø培养温度一般设在25℃
Ø光照温度一般在1000-5000勒克斯,常用3000-4000勒克斯
Ø光照长度一般在10-16小时
Ø相对湿度保持在70-80%为宜。
4.温室
在温室栽培材料,供植物组织培养取材之用,为组织培养提供健康的植物材料,从而使初代污染得到有效的控制。
温室也为试管苗的生产化提供良好的炼苗场所和生产基地。
二、基本设备
1.玻璃器皿
培养器皿:
包括试管、三角瓶、培养皿、果酱瓶等。
分注器:
分注器有注射器式分注器、漏斗式分注器和量筒式分注器等类型。
其它的玻璃器皿:
烧杯、量筒、移液管、移液枪、容量瓶、试剂瓶等。
2.器械类
镊子类:
以枪式镊子在接种、转移时使用比较方便。
解剖刀、剪刀类、接种针
细菌过滤器:
漏斗型、注射型两种
3.仪器设备
超净工作台:
水平和垂直工作台两种。
高压灭菌锅:
有大型、中型和小型三种。
高压灭菌锅使用时注意以下几点:
a.添加足够的水量;b.锅内气压不超过1.5个大气压;c.灭菌后,在气压表归零之前不要打开锅盖。
d.橡胶等有机物品会因高温高压而变性。
e.高压灭菌锅内有一个自动排气的小孔,不要使其堵塞。
烘箱:
玻璃器皿洗净后,有必要时,可使用烘箱干热灭菌(150℃,1-3h)。
而只进行洗净后烘干,可设置在80℃左右。
培养用仪器设备:
空调机、加湿器和去湿机,定时器、培养架,摇床和旋转床,恒温恒湿光照培养箱、生化培养箱。
药品贮存和配置仪器设备:
冰箱、天平、酸度计。
培养架:
用木材或三角铁制成,每层可用铁丝网或玻璃板分隔,在培养架上放置培养瓶。
用铁丝网分隔时,光照效果虽然不如玻璃板,但热量扩散效果好。
而用玻璃板作为隔板时,光照效果好,但有时会造成局部温度过高的现象。
培养架的长度根据所采用的日光灯长度来确定,高度以4-5层为宜,每层高40厘米左右,宽度约40厘米。
观察分析仪器设备:
实体显微镜、普通光学显微镜、倒置显微镜、普通荧光显微镜。
照相设备:
包括相机、近摄镜等。
组织切片设备:
包括切片机、染色缸、烘片器等.
其它仪器设备:
离心机、蒸馏水制水装置、水浴锅、药品柜和晾干架等。
第2节基本操作
一、洗涤
重铬酸钾洗净法:
一般的玻璃器皿在用重铬酸钾洗液浸泡之前,应先用水洗净。
晾干后再放入重铬酸钾洗液中,浸泡一夜。
第二天取出用自来水冲洗后,再用蒸馏水冲洗。
洗涤剂洗净法:
重铬酸钾洗液会造成环境污染,而用普通无磷中性洗涤剂是一种理想的选择。
超声波洗净法:
对于比较顽固的污垢也十分有效。
玻璃器皿的清洗:
新购置的玻璃器皿:
先用1%稀HCl浸泡一夜,然后用肥皂水洗净,清水冲洗,最后再用蒸馏水冲淋1遍,烘干备用。
已经用过的培养器皿:
先将用过的培养基除去,然后用洗涤剂溶液浸泡,再用刷子刷洗,自来水冲洗,最后用蒸馏水冲洗后烘干备用。
杂菌污染的玻璃器皿:
不开盖即把它们放入121℃高压蒸汽锅中灭菌后,再清洗。
切忌被杂菌污染的玻璃器皿直接用水清洗,否则会造成培养环境的污染。
洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀,不挂水珠。
二、灭菌
1.器具的灭菌
干热灭菌法:
在150℃恒温干燥箱内保温2小时,取出冷却后便可以使用。
高压蒸汽灭菌法:
一般在121℃下保持15-20min,就可以达到灭菌效果。
2.培养基的灭菌
高压灭菌法:
放在高压灭菌锅内灭菌,一般在121℃下保持15-20min。
过滤除菌法:
当培养基中含有高温下易分解或变性的物质时,如生长调节物质、酶等,可以采用过滤方法进行除菌。
部分除菌法:
先将高温下易破坏的有机成分配成水溶液,进行过滤除菌后,放在超净工作台内。
培养基中的其它成分按正常方法配制并进行高压灭菌,将二者在超净工作台内配合、定容后分装。
过滤灭菌Ⅰ:
1.过滤器先灭菌,灭菌温度不超过121℃。
2.溶液先进行初滤(滤膜Ø0.65um)
3.接种材料的灭菌
灭菌步骤:
①流水冲洗或洗衣粉漂洗;②用化学灭菌剂浸润灭菌,最好加吐温-80等表面活性剂(灭菌液的0.5%),一般70%酒精30S,0.1-1%升汞5-8min。
③无菌水冲洗3-10次。
注:
灭菌液要浸没材料
常用灭菌剂的使用浓度与效果比较
灭菌剂使用浓度持续时间去除难易效果
次氯酸钙9-10%5-30min易很好
次氯酸钠2%5-30min易很好
氯化汞0.1-1%5-8min较难最好
抗菌素4-50mg/L30-60min中较好
三、无菌操作
1.在实验之前30min将超净工作台的紫外灯打开,进行杀菌。
做实验时将紫外灯关闭。
2.用酒精喷壶或酒精棉,将超净工作台消毒。
实验操作前,手和小臂也要用70%的酒精消毒。
实验器具用酒精喷壶消毒之后,放在超净工作台面上待用。
3.点燃超净工作台上的酒精灯,在植入或移植材料的前后,培养瓶的瓶口需在酒精灯火焰上烧烤杀菌。
4.使用的镊子、解剖刀等,用90%的酒精浸泡,之后放在酒精灯上火烧灭菌,放在灭菌支架上冷却后使用。
5.在进行材料的切割与移植时,所有的操作应该始终保持无菌状态。
第3节培养基
培养基的种类、成分等直接影响培养材料的生长发育,应根据培养材料的种类和部位,选取适宜的培养基。
不同的培养基特点不尽相同,了解和分析它们的特点,既便于人们选择合适的培养基,又可以在组织培养中开发新的培养基。
一、培养基的成分:
1、水2、无机营养物(无机盐)3、有机营养成分4、植物生长调节物质5、琼脂6、PH7、抗褐变物质
1、水分
常用蒸馏水来配制培养基,而最为理想的水应该可能是纯水。
纯水的制造:
首先要经过蒸馏装置除去大部分金属离子成分,然后再经过离子交换树脂除去那些与水分一起蒸馏的杂质。
在生产上,有时为了降低成本,也可以用高质量的自来水来代替蒸馏水。
由于自来水中除了含有大量的Ca、Mg、Cl和其它金属离子外,还会含有有机物质。
因此最好将自来水煮沸,经过冷却沉淀后再使用。
2.无机营养物(无机盐16种必需元素)
大量元素:
包括有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。
氮元素可以有两种形态:
即硝态氮和铵态氮。
硝态氮通常以硝酸钾(KNO3)、硝酸铵(NH4NO3)的形式添加。
微量元素:
包括有Fe,B,Mn,Cu,Zn,Mo,Cl。
需要量很少,一般大多为10-5—10-7mol/L,稍多则产生毒害,Fe对叶绿素的合成以及延长生长起重要作用,通常以硫酸亚铁和EDTA螯合物的形式出现在培养基中。
3.有机营养成分
(1)碳源和能源
糖类:
蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等。
蔗糖用得最多,效果也最好。
糖的添加浓度:
以添加浓度30g/L较多。
不同糖类对生长的影响不同。
从各种糖对水稻根培养的影响来看,以葡萄糖效果最好,果糖和蔗糖相当,麦芽糖差一些。
不同植物不同组织的糖类需要量也不同,实验时要根据配方规定按量称取,不能任意取量。
(2)维生素类:
盐酸硫胺素(Vit.B1)盐酸吡哆醇(Vit.B6)烟酸(Vit.B3或Vit.pp)
叶酸(Vit.B11)钴胺素(Vit.B12)生物素(Vit.H)抗坏血酸(Vit.C)
注:
一般使用浓度为0.1-1.0mg/L
VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。
Vc有防止组织变褐的作用。
(3)肌醇
使用浓度一般为50-lOOmg/L,适当使用肌醇,能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。
对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用,对细胞壁的形成也有作用。
(4)氨基酸及有机添加物
氨基酸及其酰胺类物质:
培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸,其他的如精氨酸、谷氨酸,谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。
水解乳蛋白(CH)和水解酪蛋白(LH):
它们是牛乳用酶法等加工的水解产物,是含有约20种氨基酸的混合物,用量在100-200mg/L之间。
由于它们营养丰富,极易引起污染。
如在培养中无特别需要,以不用为宜。
天然有机物:
椰子乳、番茄汁、酵母提取物(0.5%)
4.植物生长调节物质:
(1)生长素类
(2)细胞分裂素类(3)赤霉素(GA)(4)脱落酸(ABA)(5)乙烯
(1)生长素类
在培养基中添加生长素的作用:
主要被用于诱导愈伤组织形成,诱导根的分化,另外还有促进细胞分裂、伸长生长的作用。
在促进生长方面,根对生长素最敏感。
在极低的浓度下,就可促进生长,其次是茎和芽。
天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏。
萘乙酸(NAA);2,4—二氯苯氧乙酸(2,4—D);吲哚乙酸(IAA);吲哚丁酸(IBA)
强弱顺序为:
2,4—D>NAA>IBA>IAA;浓度范围大都在10-5-10-7mol/L
(2)细胞分裂素类
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用:
诱导芽的分化,促进侧芽萌发生长;促进细胞分裂与扩大;抑制根的分化。
因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低。
6—苄基腺嘌呤(6—BA);激动素(Kt);玉米素(Zt);2-异戊烯腺嘌呤(2-ip);噻重氮苯基脲(TDZ);
强弱顺序为TDZ>Zt>2-ip>6-BA>Kt;适用浓度范围在10-5-10-7mol/L
(3)赤霉素和脱落酸
在组织培养中添加赤霉素的作用:
培养基中添加的是GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株。
赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响,当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化,比值低时有利于韧皮部分化;此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。
因此一般在器官形成后,添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
如在菠菜的组织培养时,GA3对器官的形成表现了良好的促进作用。
在组织培养中添加脱落酸的作用:
ABA有抑制植物生长,促进休眠的作用。
在资源保存和超低温冻结保存时,可以用ABA来促进植物组织培养休止生长和抗寒性形成,以使冻结保存获得成功。
5.琼脂
最常用的凝固剂是琼脂,一般情况下,纯净度高,含杂质少的琼脂,用量一般在6-10g/L.若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去。
若浓度过低,凝固性不好。
琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何营养。
琼脂能溶解在热水中,成为溶胶,冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。
通常所说的“煮化”培养基,就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。
根据培养基培养方式不同分类:
固体培养;液体培养(静止培养,旋转培养,纸桥培养,振荡培养)
影响培养基凝固力的因素:
(1)新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。
原料、厂家的加工方式与琼脂凝固能力有关。
一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。
(2)琼脂的凝固能力与高压灭菌时的温度、时间有关。
加热时间过长,温度过高,会使培养基凝固能力下降。
(3)琼脂的凝固能力与pH值有关。
过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解,丧失凝固能力。
培养基PH偏低时,琼脂用量要增加。
(4)时间过久,琼脂变褐,也会逐渐丧失凝固能力。
6.PH值
培养基在灭菌前,PH值一般被调节到5.0-6.0之间,最常见的为5.7-5.8。
在调整PH时,通常用1mol/L或0.1mol/L的NaOH和HCl来进行。
当PH过高时,培养基会变硬;当PH过低时,会影响培养基的凝固。
7.其它添加物
有时为了减少外植体的褐变,需要向培养基中加入一些防止褐变的物质,如活性炭、维生素等。
在培养灭菌比较困难的植物材料时,也可以添加一些抗生素物质,以此来抑制杂菌生长。
二、培养基的选择
1.培养基的4个基本类型
(1)含盐量较高培养基
其代表是MS(Murashige和Skoog,1962)培养基.其主要特点是无机盐浓度高,特别是钾离子和铵离子含量丰富。
元素平衡较好,缓冲性能好,微量元素和有机成分含量齐全且较丰富,是目前使用较广的培养基。
广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好。
有些培养基是由它演变而来的。
(2)硝酸钾含量较高的培养基
硝酸钾含量较高的培养基有B5培养基、N6培养基,SH培养基。
B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。
其主要特点是含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用。
从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物。
N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。
其特点是成分较简单,KNO3和(NH4)2SO4含量高。
在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。
(3)低无机盐培养基
其代表是怀特培养基(White,1943)。
其特点是是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。
1963年又作了改良,称作White改良培养基,提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。
其特点是无机盐数量较低,适于生根培养。
(4)中等无机盐含量的培养基:
有Nitsch(1969)培养基等。
三、培养基配制
1、母液的配制
为什么要配制母液?
1)方便2)准确(有些成分量太小) 3)母液要分类配,否则有些成分混合一起会产生沉淀
2.母液的配制方法
母液的配制一般采用混配法。
即混配法:
将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量,分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液。
(1)大量元素母液:
以原用量的10倍配制(10~50倍),用0.01托盘天平按配方次序称取,分别溶解,混合定容1000ml。
(2)微量元素母液:
一般配制100倍,定容1000ml,称量时最好用万分之一的分析天平。
(3)铁盐母液:
亦配制100倍,硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)一般比原用药量扩大100倍,分别溶解后,混合后再螯合30分钟,最后定容1000ml。
具体方法如下:
在装有400ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠,溶解后加入3.73gEDTA-Na2,加热使其全部溶解,然后边搅拌边慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解,冷却后定容至500ml,置于冰箱中备用。
铁盐母液必须储存于棕色玻璃瓶中。
(4)有机营养母液:
与配制铁盐相同,比原用量扩大100倍,定容1000ml。
(5)生长调节物质母液:
配制要求更为严格。
各种激素分别配制其母液,一般浓度0.5~1mg/ml,1次配成50或100ml,贮存于冰箱中备用。
通常母液的浓度是培养基浓度的10倍、100倍或更高。
生长素类配制方法:
IAA、2.4-D、NAA、IBA为有机的酸,制备时用碱液溶解。
可用少量0.5mol/L的NaOH或95%酒精溶解后再定容。
例如:
IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容;
NAA先溶于热水或95%酒精再加水;
2,4—D可用1mol/L的NaOH或KOH助溶,加入温水定容。
IAA的溶解方法:
一般称25mgIAA,加0.1mol/LNaOH2~3ml,溶解后,加水定容25ml,即为IAA1mg/ml,也可用无水乙醇溶解后定容。
细胞分裂素类配制方法:
一般先用少量1的HCl加热溶解后,再加入温水冷却后定容。
例如:
KT、BA先溶于1mol/LHCl溶解后加水定容
配制母液的注意事项:
①配制倍数不宜过高,这样一方面可避免一时用不完造成的浪费,另一方面也可避免倍数过高,吸取量相对少而影响准确性。
②无机盐类母液配制好后应放在2~4℃冰箱内保存。
维生素等有机营养元素的母液要在冷冻箱内保存,在使用前取出,在温水中溶解后取用。
③母液贮备时间不宜过长,尽量作到有计划配制,预期用完为宜。
过长时宜出现沉淀和微生物污染。
母液配制流程图:
确定培养基--------称量---------溶解-------定容----------母液分装--------贴标签------保存于冰箱
3.培养基配制的具体步骤:
1)取出母液并按顺序放好,并将有机营养物质融化待用。
将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置。
2)取一支烧杯,放入1/3左右(配制培养基总量的1/3)纯水,将母液按顺序加入,并不断搅拌。
3)加入植物生长调节剂和蔗糖(25-30g/L),待糖溶解后定容。
4)加入琼脂7-10g/L,并加热使其完全溶解。
5)调整PH值。
用预先配制好的1mol/L的NaOH和HCl进行调整。
PH值在5·6-5·8范围内适合大多数植物细胞的分裂、生长和转化。
6)将培养基分装到培养器皿中,封好瓶口。
100ml的三角瓶约装入30-40ml,35瓶/L。
7)用高压锅灭菌(121℃,20min)或过滤除菌。
8)灭菌后,待高压锅温度下降到60℃以下时,便可以取出,放冷凝固后待用。
移母液
大量元素母液---------取100ml---------容量瓶
微量元素母液---------取10ml----------容量瓶
铁盐母液-------------取10ml----------容量瓶
有机物母液------------取10ml----------容量瓶
要求:
一次性移取,不能吸进吸气球里,数量看准,不滴不漏,吹净为度。
注:
MS培养基配制
定容:
用蒸馏水定容至1升
分装:
趁热分装,100ml的三角瓶约装入30-40ml,35瓶/L。
第4节培养条件
1.温度一般为25℃,最高不高于35℃,最低不低于15℃.
2.湿度瓶内:
培养初期接近100%,随着培养时间的推移,水分会逐渐逸失,相对湿度也会有所下降。
培养室内的相对湿度,常年保持在70-80%为宜。
3.光照光强3000-4000勒克斯光照时间:
16小时/天
4.光周期
光周期是指昼夜周期中光照期和暗期长短的交替变化.试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养,在一般情况下培养室的光周期被设定为16h的光照,8h的黑暗。
5.培养基的PH
不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的,大多在5-6.5左右,一般培养基PH皆要求5.7-5.8,这基本能适应大多植物培养的需要。
一般来说当pH值高于6.5时,培养基全变硬;低于5时,琼脂不能很好地凝固。
因为高温灭菌会降低pH值(约0.2—0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值0.2—0.3单位。
lml的NaOH可使pH值升高0.2单位,lml的HCl可使pH值降低0.2单位。
调节时一定要充分搅拌均匀。
6.气体氧气:
缺氧时不利于组织生长。
乙烯:
含量过高时,不利于组织生长
二氧化碳:
含量过高时,不利于组织生长
第5节植物组织培养中经常出现的问题与解决的办法
一、初代培养外植体的褐变(browning)
外植体褐变是指在接种后,其表面开始褐变,有时甚至会使整个培养基褐变的现象。
它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活,而使细胞的代谢发生变化所致。
在褐变过程中,在褐变过程中,会产生醌类物质,它们多呈棕褐色,当扩散到培养基后,就会抑制其它酶的活性,从而影响所接种外植体的培养。
(一)褐变的主要原因如下:
1、植物品种:
研究表明,在不同品种间的褐变现象是不同的。
由于多酚氧化酶活性上的差异
2、生理状态:
由于外植体的生理状态不同,所以在接种后褐变程度也有所不同。
一般来说,处于幼龄期的植物褐变程度较浅,而从已经成年的植物采收外植体,由于含醌类物质较多,因此褐变较为严重。
3、培养基成分:
浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加。
此外,细胞分裂素的水平过高,也会刺激某些外植体的多酚氧化酶活性,从而使褐变现象加深。
4、培养条件不当:
如果光照过强、温度过高、培养时间过长等,均可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养外植体的褐变程度。
(二)褐变的防止措施:
1、选择合适的外植体:
一般来说,最好选择生长旺盛的外植体。
这样可使褐变现象明显减轻。
2.合适的培养条件:
无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
3.添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂包括抗氧化剂和多酚氧化酶(PPO)抑制剂,前者包括抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,后者包括二氧化硫、亚硫酸盐、氯化钠等。
在培养基中加入褐变抑制剂,能较为有效的避免或减轻很多外植体的褐变现象。
PVP是酚类物质的专一性吸附剂,常用作酚类物质和细胞器的保护剂,用于防止褐变。
另外,使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
4、连续转移
对于容易褐变的材料,在外植体接种后1-2天立即转移到新鲜培养基中,可减轻酚类物质对培养物的毒害,连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题,褐变现象便会得到控制或大为减轻。
二、玻璃化:
在进行植物组织培养时,经常会出现“玻璃苗”,即试管苗生长异常,叶、嫩茎呈透明或半透明水浸状,植株矮小肿胀,失绿,叶片皱缩成纵向卷伸,脆弱易碎,这种现象称为“玻璃化”。
它的出现会使试管苗生长缓慢,繁殖系数有所下降。
玻璃化为试管苗的生理失调或生理病变,很难继续继代培养和扩繁。
成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍,是组织培养的一大难题。
具体解决的办法如下:
(1)适当控制培养基中无机盐成分,适当提高蔗糖和琼脂浓度,增加培养基中溶质的水平,以降低培养基的水势。
(2)减少培养基中含氮化合物的用量。
(3)适当降低培养基中CTK和GA的含量。
考虑加入适当的脱落酸。
(4)增加自然光照,控制光照时间;增加容器通气,控制温度(降低培养温度,进行变温培养)有助于减轻试管苗玻璃化现象发生。
三、污染
1.含义:
在组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。
2.污染原因:
细菌、真菌为病源菌;污染途径有外植体带菌,培养基及器皿灭菌不彻底,操作人员未遵守操作规程,环境不清洁。
3.污染的预防措施:
(1)防止材料带菌:
避免阴雨天在室外采集外植体;春秋组培;材料预培养。
(2)严格外植体灭菌 (3)接种用具灭菌彻底 (4)严守无菌操作规程 (5)保持培养室清洁
4.抗生物质(antibiotic)有青霉素、链
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