本科毕业设计海月水母生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究.docx
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本科毕业设计海月水母生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究
青岛理工大学
学士学位毕业论文
海月水母生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究
院系:
环境与市政工程学院
专业:
环境科学
学生姓名:
唐雨慧学号:
200805013
论文地点:
中国科学院海洋研究所
指导教师:
李捷职称:
教授
2012年6月
海月水母(Aureliaaurita)生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究
摘要
海月水母(Aureliaaurita),是广泛分布于世界各海区的一种大型水母,主要在暖海和温带,我国大连、烟台、威海和青岛等地沿海均有分布,成体伞径一般为100~200毫米。
海月水母作为刺胞动物门(Cnidaria)、钵水母纲(Scyphozoa)的代表,是生物学教学和科研的良好材料,也可作为水族馆的观赏动物。
本文通过对养殖海月水母的取样并在显微镜下观察到,雌性海月水母的卵子在生殖腺中分批成熟,大小不一,成熟的卵子的大小在100
m左右,近似圆形,分布较稀疏;雄性海月水母的精子存在于精子囊中,而精子囊存在于生殖腺中,排列较紧密,形状不规则,大小一般不到100
m,当精子囊破裂时,精子会从精子囊流出,精子的头部呈长棒状,尾部有很长的鞭毛,总长度在50~70
m左右,运动活跃,并做不规则运动。
将雄性海月水母的生殖腺适当破碎并与适当浓度的冷冻保护液(如二甲亚砜)以1:
4或1:
5的比例混合均匀后,用液氮冷冻10分钟后取出,放入370C的恒温水浴箱中解冻,待冷冻的混合液全部融化后,生殖腺中的精子仍然有活力。
这说明,海月水母的精子在遇到液氮如此低的温度时,在冷冻保护剂二甲亚砜的作用下,低温会导致精子休眠,并不会导致其死亡。
若采用适当的方式解冻,可以使精子复苏,重新恢复活力。
由卵子与精子的混合实验结果可以证实,海月水母的受精方式是体内受精,即雄性海月水母排出的精子进入雌性海月水母的生殖腺中与成熟的卵子结合成受精卵。
关键词海月水母,生殖腺,卵子,精子,人工受精,冷冻保存
TheObservationofGermCellsofAureliaauritaandtheCryopreservationofItsSperm
Abstract
Aureliaaurita,alsoknownaswaterjellyfish,isalargejellyfishwhichwidelydistributedintheseaareasoftheworldandmainlydistributedinwarmseaandtemperatezone.TheyalsodistributedalongthecoastofDalian,Yantai,Weihai,QingdaoandotherplacesofChina.Theumbrelladiameterofmatureindividualsisgenerallyfrom100to200mm.AureliaauritaistherepresentativeofCnidariaandScyphozoa,canberegardasagoodmaterialforbiologicalteachingandresearch,andtheaquariumornamentalanimals.Inthispaper,takesamplesfromtheculturedAureliaauritaandobservedunderamicroscope,itcanbeseenthatinthegonadofthefemaleAureliaaurita,theeggsmatureinbatchwithdifferentsize,andthesizeofthematureeggsisabout100
m.Theeggsarenearlycircular,anddistributedsparselyin.ThespermofthemaleAureliaauritapresentintheantheriduminthegonad.Theantheridumsarrangedclosely,theshapeareirregular,andthesizesaregenerallylessthan100
m.Thespermwilloutflowfromtheantheridumwhentheyareruptured.Theheadofthespermiselongatedrod-like,andthetailwithverylongflagella,andthetotallengthofitisabout50~70
m.Theydoirregularmovementandareveryactive.DosomeappropriatebrokentothegonadsofthemaleAureliaauritaandmixwiththeappropriateconcentrationofcryoprotectantsolution(suchasdimethylsulfoxide)toaratioof1:
4or1:
5.Afterfreezingtheminliquidnitrogenfor10minutes,removingandputtingthemin37oCthermostatwaterbathtothawthem.Whenallthefrozenmixtureismelted,thesperminthegonadisstillviable.Thisshowsthat,whenthespermofAureliaauritaundersuchalowtemperatureofliquidnitrogen,theywouldnotbekilledbutbeindormantwiththeeffectofthecryoprotectantdimethylsulfoxide.Ifthawthemintheproperway,thespermwouldrecoveryandregaintheirvitality.BytheresultoftheeggandspermmixingexperimentcanbespeculatedthatthewayofthefertilizationofAureliaauritaisinvivofertilization,thatistheexcretedspermofthemaleAureliaauritaenterthegonadsofthefemaleonescombinedwiththematureeggsintothefertilizedeggs.
KeywordAureliaaurita,gonad,egg,sperm,cryopreservation
前言
水母作为胶质浮游动物的一大类群,包括刺胞动物门(Cnidaria)的水螅水母(Hydromedusae)、管水母(Siphonophore)、钵水母(Scyphomedusae)、立方水母(Cubomedusae)以及栉水母门(Ctenophora)的栉水母(Ctenophore)5大类。
目前全球已鉴定出大约840种水螅水母,200种管水母,190种钵水母,20种立方水母,以及150种栉水母。
根据已有资料(刘瑞玉主编《中国海洋生物最新种类名录》)。
我国近海已经记录的水母420多种,约占全球已记录种类的三分之一。
由于水母种类多、数量大、分布广,因此它们在浮游动物群落中占有相当重要的地位。
近年来,在全球一些近岸高生产力海湾或海区,由于越来越多的人类活动及气候变化使海洋生态环境发生了很大的变化,不同种类的水母在全球许多海域中的数量增加甚至出现了暴发的事件(Jellyfishandctenophorebloom),使得部分能量传递从原来的鱼类到了水母类。
比如:
白令海东部大型水母啡海刺水母(Chrysaoramelanaster)的生物量20世纪90年代比80年代增长了10倍,黑海的海月水母(Aureliaaurita)20世纪80年代末达到了大约3–5亿吨。
同样,地中海、纳米比亚、南非西海岸、墨西哥北部湾及南大洋等海域均不同程度地呈现水母数量增多的现象,对当地造成了严重的经济和生态损失。
在东亚海域,1990年以后,日本濑户内海的超富营养化(N:
P比例很高),使得水母大量旺发,相应海域的渔业产量由1982年至1993年12年间下降了43%。
自20世纪90年代中后期起,我国渤海辽东湾、东海北部和黄海南部海域也相继出现了大型水母暴发的现象,并有逐年加重的趋势,尤其是2003年可谓是“水母年”,因之而起的网具暴破、网眼堵塞、传统渔场无法生产等情况已严重影响了东、黄海夏秋汛的海洋渔业生产。
由于水母和许多鱼类及其仔鱼存在摄食竞争,因此当水母大量增长时,水域中浮游生物的数量在短时间内急剧下降,甚至可降至为零,从而可能造成仔、稚鱼饥饿甚至死亡,使本来业已匮乏的渔业资源更得不到及时的补充。
由此可见,水母数量的增长已经成为一种海洋生态灾害,其危害可与赤潮相比[1]。
海月水母(Aureliaaurita)是海洋中大型的浮游动物,隶属钵水母纲旗口水母目洋须水母科海月水母属[2],在70°N~40°S海区的浅海海域均有分布,但海流稳定的温带浅海海域是其最适和最主要的分布区域[3]。
在我国大连、烟台、威海和青岛等地沿海均有分布[4]。
近半个多世纪以来,在全球许多海域都发生过海月水母爆发事件,引起了各种各样的社会、经济和生态问题,2007年6~9月初,山东烟台港及威海近海海面发生了大规模的海月水母爆发事件。
海月水母和其它大型胶质状浮游动物一样,它们的爆发会对海洋生态系统造成巨大的危害,对海洋渔业经济等造成恶性影响。
在过去的100年里,学者们已对海月水母进行了广泛的研究,但国内目前专门针对海月水母的研究较少。
虽然目前很多研究和商业部门的科研人员通过不断观察与试验,已经掌握了海月水母繁殖过程的关键技术环节,实现了人工繁殖,为使水母长期展示与科普提供了一定的保障。
但对于海月水母雌雄生殖细胞及人工受精方面的研究较少。
为了解决雌雄水母个体的生殖细胞成熟不同步的问题,本文将对海月水母雌雄生殖细胞的形态、受精卵的卵裂增殖及浮浪幼虫的形态作详细描述,并对海月水母的精子做冷冻保存做初步研究。
第一章海月水母的研究概述
1.1海月水母的形态及生活习性
海月水母体为圆盘状,无色透明,直径为10~40cm,身体水的含量达98%,水母体主要由外伞、内伞、口腕和胃囊四部分组成,成熟个体的胃囊的底部还有生殖腺,从伞的顶部即可看到体内4个马蹄形褐色生殖腺。
伞的边缘生有触手,并有8个缺刻,每个缺刻中有1个感觉器即触手囊,囊下面有缘瓣,缘瓣上有感觉细胞和纤毛;在内伞的中央有1个呈四角形的口,4个口角处称主辐,有4条分枝的主辐管;主辐之间为间辐,有4条分枝的间辐管;主、间辐之间为从辐,有8条不分枝的从辐管;这16条辐管均连于伞缘的环管,构成复杂的胃循环腔。
口的四角上伸出4条口腕(图1.1)[4],口腕上有许多刺细胞,可放出刺丝麻痹猎物,再将它吞入口中。
海月水母主要以浮游动物为食,如:
桡足类、软体动物、枝角类、鱼卵和鱼仔,有时它们也吃小的水螅水母类和栉水母类。
水母体依靠外伞有节奏地跳动来浮游,浮游时外伞向上内伞向下,并保持其伞始终接近水表面,使触手最大限度地展开,以便更好地捕捉食物。
不同种群伞径大小相差较大,Lucas认为当种群数量较大时伞径小,而种群数量小时伞径大[3]。
图1.1 海月水母的结构(口面观)[4]
Fig.1.1 ThestructureofA.aurita(oralview)[4]
1.2海月水母的分布和生境
海月水母目前是1种全球性分布的物种,广泛分布于70°N~40°S海区的浅海海域。
这些海域的港湾、海峡和入海口等处因有适合螅状体生存的底层物质,是海月水母容易聚集的场所,海流稳定的温带浅海海域是其最适和最主要的分布区域[3]。
有学者认为它原是仅限于北大西洋的1个物种,19世纪和20世纪频繁的海运活动把它们带到了世界各地[5]。
比较了海月水母生存的海域环境状况后发现,这些海域的潮流、水深、温度、盐度和营养情况等差别较大(表1.1)[6],说明海月水母对环境的适应能力较强。
海月水母对温度和盐度的适应范围极广,如瑞典Gullmarfjord湾的海月水母种群要经历冬季的冰封期[7],而帕劳的水母湖中的海月水母种群却生活在表层水温度常年维持在31~32℃的水体中[8];海月水母既分布于S为14~22的丹麦KertingeNor[9],也存在于S高达38的希腊Elefsis湾中[10],Russell还发现了生存于S小于10的海月水母种群[11]。
从表1中还可以推测出,海月水母对生存水体的营养输入量、生产率和食物可利用率的要求也很宽泛,如英国Horsea湖没有河流输入来提供营养,浮游动物在数量和种类上都少,但海月水母的生物量仍可达43mg·C·m-3[12];另一方面,海月水母在受污染(英国SouthamptonWater)[13]、富营养化且底层水缺氧(希腊Elefsis湾)[10]的水系中亦大量存在。
但学者研究还发现,在水体小、水深浅、半封闭或全封闭且潮流交换受限的水体系统中,水母体种群数量较大,而在开放或较深的水域中种群数量要小很多,因为频繁的潮流交换会使海水变得混浊,初级产物较少,不利于水母体的摄食和繁殖,而稳定的水体环境对螅状体的底栖生活和水母体的浮游生活都很有利[14]。
1.3海月水母的生活史
海月水母的生活史包括2种不同形态的生活世代(图1.2)[15]:
营固着生活的无性水螅体世代和营浮游生活的有性水母体世代。
水母体雌雄异体,精子由雄性个体的口排出,经雌性个体口腔进入体内和卵结合,受精卵顺水流至口腕边缘,并在此发育成浮浪幼虫;浮浪幼虫离开雌性水母,以前端附着外物,发育成早期的螅状体;螅状体以出芽生殖不断形成新的螅状体,并经过一段较长的营养时期,发育为钵口幼体,开始连续进行横分裂,形成叠在一起的许多节盘,称为横裂体;横裂体节盘脱落产生碟状体,进一步发育为幼水母体,约经80d可达性成熟[16]。
世界各地海月水母种群的生活史都相同,但因所处环境不同,发育时间有所不同,呈现出明显的地域差异(表1.1)。
但总体而言,碟状体的出现多集中在11月到翌年3月,消失多集中在2月到5月,只有帕劳的水母湖(JellyfishLake)中的碟状体全年都存在;水母体出现大都始于4、5月份,6到10月消失,但在5个海域(水母湖、黑海、台北湾、日本的Urazoko、Tokyo湾)全年都可见到水母体。
水母体的寿命一般为4~8个月,但Yasu2da[17]和Hamner[18]分别于1971和1974年报道了在日本Kagoshima湾和帕劳的水母湖有寿命超过1a的水母体;Miyake在1997年则称在日本Kagoshima湾中有寿命超过2a的水母体,且能2次排卵[19]。
海月水母种群增长有3个典型阶段,在冬季和春季大部分时间,增长较慢;在温度和食物较充足的春末时进入指数增长期;在夏季和秋季水母体一旦生殖后种群数量便很快萎缩。
图1.2 海月水母生活史[15]
Fig.1.2 LifehistoryofA.Aurita[15]
1.4全球海月水母爆发事件及其危害
水母爆发属一种自然现象,因其生长具有季节性,即使在未受干扰的情况下
表1.1全球海月水母种群的主要栖息地环境状况及其碟状体、水母体出现时间[6]
Table1.1HabitatsandtheirenvironmentofA.auritapopulationandtimingofephyraeandmedusaeoccurrenceintheworld[6]
地点类型特点水深/m最高丰度个·m-3碟状体出现月份水母体出现月份
Gullmarfjord,瑞典开放海峡冬季结冰12014.9610—翌年4月5—8
JellyfishLake,帕劳半封闭咸水湖含硫化物300.30全年全年
KertingeNor,丹麦半封闭海峡2~33002—34—9
ElefsisBay,希腊半封闭海湾缺氧33441—45—10
HorseaLake,英国半封闭咸水湖无河流6~724.911—翌年6月1—12
SouthamptonWater,英国半封闭入海口工业污染158.712—54—6
Kielfjord,KielBight,德国开放海峡80.3311—翌年6月4—10
EckernfêrdeBay,KielBight,德国开放海峡200.33无数据无数据
KielBight,德国开放水域无数据0.1611—翌年8月4—11
BlackSea开放水域淡水水母入侵>2002113—5全年
Vaügsb
pollen,挪威半封闭海湾1222.3无数据无数据
Isefjord,丹麦开放海峡冬季结冰9无数据11—翌年3月4—10
WaddenSea,荷兰开放水域北海5~100.493—54—8
UrazokoBay,日本半封闭海湾无数据7112—翌年5月全年
TokyoBay,日本开放海湾无数据1.533—5全年
TapongBay,中国台湾半封闭海湾2.214.1512—翌年4月全年
威海海域,中国半封闭海湾富营养化1121.42无数据6—9
也可能发生爆发。
但在过去几十年中受人类活动的影响,海洋生态系统正发生着变化。
一些海域出现了前所未有的水母爆发现象,引起了各种各样的社会经济问题,在国际上引起了广泛的关注[20],日本海域尤为严重。
早在1891年在日本海域就发现了海月水母的存在[21],1950年日本海海月水母爆发引起了渔场生产受阻[22],20世纪60年代,日本多次发生海月水母阻塞沿海发电厂水循环系统并引起发电厂发电受阻事件,甚至引发了全日本的发电厂临时停止工作[23]。
此类事件已波及全球,如韩国、印度、沙特阿拉伯、澳大利亚、菲律宾等海域[24]。
此外,引人注目的还有发生于希腊Elefsis海湾、丹麦KertingeNor、英国Horsea湖、挪威VaÜgsb
pollen和黑海的海月水母爆发事件给当地带来的不小的经济损失。
2007年6~9月,我国山东省烟台和威海沿海也曾发生十分罕见的海月水母大规模爆发事件[25],2009年7月在青岛又发生了海月水母“围攻”青岛发电厂事件[26]。
事实上,除海月水母外,霞水母(Cyaneanozaki)[27]也是我国黄渤海海域易爆发的水母种类。
海月水母的爆发会破坏海洋生态系统的物种结构。
海月水母是海洋生态系统中浮游动物的主要捕食者之一,也是一种高效且贪婪的捕食者,爆发时大量掠食浮游动物,会对沿海浮游动物生物量有显著的控制作用[28]。
而浮游动物又是以浮游植物藻类为食,故浮游动物的减少降低了藻类的被取食压力,从而将会引起藻类的大量增加和浮游生物群落结构的变化,而藻类的增加,最终可能导致赤潮出现,也间接加剧了水体富营养化[29]。
海月水母的爆发对海洋渔业也有十分严重的危害。
通过对海月水母胃含物的分析发现,海月水母会以许多重要的经济鱼类的幼鱼为食[30],它们不仅直接捕食幼鱼,而且间接和幼鱼争夺食物资源而影响经济鱼类的固有储存量[31]。
实验证实,胶质状的水母对鱼卵和幼鱼有致命的威胁,导致鱼类产量下降[32],还会导致渔场生产受阻[22]。
因此,面对近半个世纪以来海月水母的频繁爆发,对海月水母的研究迫在眉睫,且具有重要的意义。
虽然目前对于海月水母的生活史已经明确,但是肉眼并不能区分海月水母的性别,只能通过显微镜观察其生殖细胞来判断其雌雄,而对于海月水母生殖细胞形态的描述很少涉及;大部分的研究者都认为海月水母是体内受精,但也还是有人认为海月水母可以体外受精,即在性成熟时,雌性和雄性的海月水母分别将卵子和精子排放到海水中,形成受精卵后再发育成水母幼体;海月水母受精之后从受精卵到囊胚、原肠胚和浮浪幼虫各阶段由于体型小和时间短,不容易观察和控制,因此很难得到某阶段纯的水母体,如纯的浮浪幼虫,所以对海月水母人工受精可行性的探究具有重要的意义。
本文将通过文字和照片的方式详细描述海月水母生殖细胞和浮浪幼虫的形态;将精子冷冻后再复活,观察冷冻精子的存活情况;将精子和卵子人为混合后,验证海月水母是体外受精还是体内受精。
第二章研究材料与方法
2.1海月水母生殖细胞的观察
观察的海月水母样品采自中科院海洋研究所水族楼水母养殖室。
尽量采集成熟的雌体或雄体。
把海月水母样品放在解剖盘中,用解剖剪刀剪开水母体上的一个胃,刮下一小块生殖腺组织,用塑料吸管将刮下来的生殖腺组织吸到载玻片上,并用解剖针将其划开,放到显微镜下观察。
若用4×的镜头观察到细胞为圆形,直径在100~200
m,再转换到10×的镜头,观察到细胞里面没有黑色的并不断运动的点,用牙签涂开之后,没有东西从破裂的细胞中流出,则可以判断为卵细胞,此水母为雌性;若用4×的镜头观察到的细胞形态是很不规则的肾型,大小一般不到100
m,再用10×的镜头观察到细胞内有黑色点点,则可初步判断为精子囊,此水母为雄性;用牙签将精子囊戳破,并涂抹开,若能观察到大量黑点从破裂的精子囊内流出,并运动活跃,则为精子;盖上盖玻片并滴上松柏油,再用20×的镜头观察精子的形态,并用精子专用分析软件观察载玻片上海月水母精子的活力。
若以上两种情况在某一只水母体内都没有观察到,则说明这只水母还未发育成熟,或已过繁殖期。
观察后,将没有生殖细胞的水母放回缸中,再将雌性和雄性水母分开养殖起来,以待后期使用。
2.2海月水母精子冷冻保存可行性探究
由于精子的结构简单,且活力很强,因此海月水母精子的冷冻保存存活可行性就依赖于冷冻后精子的存活能力及运动活力。
用吸管吸取适量性发育成熟的雄性海月水母的生殖腺到50ml小烧杯中,加入适量海水,先取少量生殖腺到载玻片上,用牙签挑破涂开后,放到显微镜下,镜头转换器转换到20×的镜头上,并用精子活力系统观察精子的活力。
将烧杯中剩余的生殖腺放到50C的生化培养箱里培养12h后,拿出烧杯,用同样的方法观察烧杯中生殖腺内精子的活力。
用吸管吸取发育成熟的雄性海月水母的生殖腺,并加入适量海水,用小研钵做适当研磨后作为精液。
用吸管吸取适量精液到载玻片上,观察精子的活力,作为此精液中精子的活力。
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