果酒酵母的分离纯化及选育实验报告.docx
- 文档编号:9366026
- 上传时间:2023-02-04
- 格式:DOCX
- 页数:8
- 大小:29.96KB
果酒酵母的分离纯化及选育实验报告.docx
《果酒酵母的分离纯化及选育实验报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《果酒酵母的分离纯化及选育实验报告.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
果酒酵母的分离纯化及选育实验报告
一、引言
酿酒酵母细胞透明,呈圆形或椭圆形,形体比较大,一般为7×12μm,含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。
优良纯种酵母应具备下列性能:
(1)除酿酒水果本身的果香外,酵母也应产生良好的果香与酒香。
(2)生长速度快,有较高的发酵能力,能将糖分全部发酵完。
(3)具有较高的抗S02能力,有较好的凝集力和较快的沉降速度。
(4)培养基成分简单,来源广泛,价格低廉,对温度,pH,离子强度,溶氧等环境因素不敏感。
(5)能在低温或果酒适宜温度下发酵,以保持果香和新鲜清爽的口味。
由此可见,酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。
要获得优良的酿酒酵母,必须对其进行分离选育。
果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离,如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。
根据实践经验,在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高,因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。
为使我们需要的酵母易于检出,应对采集的样品进行富集培养,通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长,使希望检出的微生物得到增殖。
酵母检出后,应对其的发酵性能进行考察,包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等,这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。
二、实验仪器与材料
样品:
新鲜苹果(未经清洗)榨汁。
YEPD培养基(富集培养基):
蛋白胨20g,葡萄糖20g,酵母膏10g,蒸馏水定容至1000ml.(每次根据需要量按如此比例配置,下同)
PDA培养基(酿酒酵母培养基):
马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸馏水定容至1000ml.(马铃薯去皮,切成块煮沸后再煮30分钟,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂溶化后定容至1000ml。
121℃灭菌30分钟。
)
PYG培养基(菌种保藏培养基):
蛋白胨3.5g,葡萄糖15g,酵母膏1.5g,KH2PO42.0g,MgSO4·7H2O1.0g,(NH4)2SO41.0g,琼脂20g,蒸馏水定容至1000ml.试剂:
亚硫酸钠、乙醇,碘液,无菌生理盐水等。
器具:
三角烧瓶(250mL)、无菌试管、无菌吸管(1mL及5mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒,血细胞计数板,显微镜,磁力搅拌器,台式离心机,震荡混合器等。
三、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛,可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。
在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富,可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。
1.酵母菌的分离初筛
1)菌种采样
样品
土壤
叶片
果实(带柄)
腐果
瓜根际土壤
藤下方土壤
垄间隙土壤
采集
方法
用无菌小铲清去表层石块露出土壤后,戴好无菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。
用无菌剪刀剪取不同生长阶段的叶片装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取不同龄期的甜瓜(幼龄期,膨大期,成熟期)分别装入无菌袋内。
用无菌剪刀摘取腐烂的果实装入无菌袋内。
随机选择三块样地采样,每样采三份,将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。
2)富集培养与纯种分离
方法:
配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却,然后分别取适量样品(土样1g,果皮5g,果柄若干,叶片若干)各三份接种,120r/min,28℃摇床培养4天。
将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上,每个样品接三个平板,28℃恒温培养。
待菌种长出小菌落,镜检为酵母菌后,将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。
待再次长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28℃恒温培养。
菌种划线三到四次后基本纯化。
2.酵母菌种的复筛
以无琼脂PDA培养液作为复筛培养基。
将初选菌种接入保藏培养基。
培养24h后每支斜面接入三角瓶培养,置于23-25℃的培养箱中培养,测定其发酵水平及产香水平,选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。
发酵力试验:
采用CO2失重法,取100mL三角瓶(已经烘干、称重),各加入80mL无琼脂PDA培养液,置于80℃的水浴杀菌5min,冷却到30℃后,按每升接种30mL的比例分别接入酵母种子液,在20℃下发酵。
发酵过程中每24h测定1次CO2损失量,每次测定时,摇晃瓶子,以排出CO2。
随着发酵时间的延续,瓶重逐渐减轻,直到减轻量不高于0.2g,即表示发酵结束,以CO2失重量为纵坐标,发酵时间为横坐标,绘制发酵力曲线,并确定菌株发酵力的强弱。
3.酵母菌的耐受性试验
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇(4%、6%、8%)、二氧化硫(20、40、60mg/L)的耐性。
将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中,在相同条件下培养,观察杜氏管中气泡产生情况,重复3次。
活化条件:
28℃条件下,将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件:
28℃条件下,水果原汁培养基中静止发酵4d;
接种量:
1×107cfu/mL(各菌种浓度在同一数量级即可)。
1)耐酒精度试验
按下表在试管中加入培养液。
然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁,塞好棉塞,115℃20min灭菌。
灭菌完后,待试管温度为常温后按下表加入酒精,加完后摇匀。
最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个,28℃静止培养。
观察产气情况,选出耐酒度比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标4、6、8,按下表每管加入各量:
试管编号
0
1#
2#
3#
95%酒精/mL
0
0.42
0.63
0.84
果汁/mL
10
9.58
9.37
9.16
培养液含酒精%(v/v)
0
4
6
8
2)耐SO2试验
按亚硫酸含量为6%计,计算出20、40、60mg/L浓度所需的量,分别加入到培养液中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。
按下表加入培养液,然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁,塞好棉塞,115℃20min灭菌。
灭菌完后,待试管温度常温后按上表加亚硫酸(科密欧试剂SO2含量≥6%),加完后摇匀。
最后在每发酵管中接入对数期酵母1×107个,28℃静止培养。
观察产气情况,选出耐SO2比较好的菌种。
将标签贴于各试管上,标1、2、3、4、5,按下表每管加入果汁量:
试管编号
0
1
2
3
亚硫酸/uL
0
3.3
6.7
10
果汁/mL
10
10
10
10
培养液含SO2mg/L
0
20
40
60
四、实验结果
1)发酵力测定
2)耐酒精度性质测定
乙醇浓度(%)
产气时间(d)
A菌
B菌
C菌
2
-
-
-
4
4
-
+
-
6
-
+
-
8
10
12
14
16
18
20
22
24
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
++
++
+
2
-
-
-
6
4
-
-
-
6
-
-
-
8
10
12
14
16
18
20
22
24
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
++
-
-
-
-
-
-
-
-
+
2
-
-
-
8
4
-
-
-
6
-
-
-
8
10
12
14
16
18
20
22
24
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3)耐SO2浓度测定
SO2浓度(mg/L)
产气时间(h)
A菌
B菌
C菌
6
-
-
-
8
+
+
-
20
10
+
++
-
12
+
+++
+
14
+
+++
++
16
+
+++
+++
18
20
22
24
++
++
++
++
++
+
+
+
++
+
+
+
6
-
-
-
8
+
-
-
40
10
+
+
-
12
-
++
+
14
+
++
+
16
-
+++
++
18
20
22
24
+
+
++
+
++
+
+
-
++
+
+
-
6
-
-
-
8
+
-
-
60
10
+
+
+
12
-
++
++
14
++
+++
++
16
+
++
+
18
20
-
+
++
++
++
+
22
+
+
+
24
+
+
+
五、结论
1)发酵力实验
如上,个发酵液整体失重走势相同,过程有个回升现象是由于在第4天测定前开盖放气且其他时间均未开盖放气的结果,应该是氧气含量的增加使得发酵增强,且发酵液中还生长有好氧细菌,所以导致空白对照也上升。
从图可以看出,前期A菌属于优势发酵菌,后期B菌成为优势发酵菌,发酵力强,C菌则发酵力最弱。
2)耐酒精性质实验
见上图,在设定的梯度上,随着酒精度的增加,酵母菌产气量降低,说明一定浓度酒精抑制其生长。
还可以看出,B菌耐酒精度较好,但C菌在低浓度酒精条件下有很好的适应性。
3)耐二氧化硫浓度实验
如上图所示,在设定的浓度梯内,随着SO2浓度的增高,菌体产气量降低,说明,一定范围内高浓度的SO2抑制酵母菌发酵。
就总体而言,B、C菌在设定的二氧化硫浓度里均具有较好发酵能力,当相对而言B菌耐SO2能力更强。
综上:
参考如上结果,B菌是最适合用于发酵的酵母菌菌种。
感想
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 果酒 酵母 分离 纯化 选育 实验 报告