血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定试验报告.docx

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血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定试验报告

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定

实验日期

实验地点

合作者

指导老师

评分

XX教师签名李某某批改日期2013-06-03

格式要求：

正文请统一用：

小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：

四号，黑体，加粗。

需强调的地方请用蓝颜色标出。

不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的

1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理

1、粗提（盐析法）：

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：

表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。

盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。

2、脱盐（凝胶层析法）

凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。

而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。

从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤

维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。

血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。

4、纯度鉴定（电泳）

采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。

比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。

三、材料与方法：

以流程图示意

材料：

1、样品：

健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）

2、试剂：

0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。

3、仪器及器材：

层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪

除盐后收

除盐

后收

后收

用1ml0.0６mol/LNH4AC缓冲液清洗层

用1ml

0.02mol/L

NH4Ac缓冲液

DEAE-纤维素

离子交换

取浓度最高的

2管均作纯度鉴定（醋

DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/L

将浸泡在巴比妥缓冲液中的醋酸纤

用盖玻片一端沾取2~3μl待测新

电将薄膜架在电泳槽上，点样面朝下，点纯

将氨基黑染色液倒入培养皿中，用镊

漂从染色液中取出以染好的薄膜放入漂洗液

结果：

1、粗提（盐析法）:

如图1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊，

呈乳白色。

离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图3），

沉淀为白色。

如图2所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。

沉淀加水

磺基

后溶解，为无色溶液（见图4）

收集含有蛋

用0.3mol/L

NH4AC缓冲液

图1血清加饱和硫酸铵溶液

磺基

收集含有清

图2分离上清液和沉淀

图3上清液

图4沉淀加水后溶解

图5DEAE-纤维素层析柱

2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：

如图5所示，往层析柱中加样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约0.5cm。

与

葡聚糖凝胶G-25层析柱相对比，DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。

如图6所示，往磺基水杨酸和BaCl2溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中含有蛋白质。

白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的1管球蛋

白进行醋酸纤维素薄膜电泳。

图6磺基水杨酸和BaCl2检测蛋白质呈阳性

红色圆圈为磺基水杨酸，蓝色圆圈为BaCl2溶

液）

4、纯度鉴定（电泳）：

如图7所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。

如图8

所示，染色后，薄膜上可见5条深蓝色横纹

ααβ

图7直流稳压电泳仪

血

清蛋白

清蛋白

γ-球

图8血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱

讨论：

1、操作失误：

1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而是接着倒入了1ml0.02mol/LNH4Ac缓冲液，导致球蛋白被稀释。

2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。

3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。

2、注意事项：

1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉淀物。

2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床/纤维素床表面，以免空气进入凝胶床/纤维素床。

3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒/纤维素粒冲起，破坏凝胶床/纤维素床表面的平整。

4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样品会被稀释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。

5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和BaCl2检验流出液是否含有蛋白质，以

免蛋白质流失过多。

6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。

7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。

但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效果。

8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。

9）点样时应做好标记，以免弄混。

标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。

3、讨论题：

1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?

在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，γ-球蛋白沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。

但硫酸铵会水解呈酸性，如果浓度大的话酸性也很强，可能使蛋白质变性。

若将血清加入饱和硫酸铵，会使部分血清蛋白变性。

所以要将硫酸铵慢慢加入血清，边滴加边摇匀。

2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?

DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

γ-球蛋白带正电荷，不与DEAE结合，会从层析柱中首先洗脱出来，所以可直接用于纯化清蛋白。

3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么

来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?

判定它们纯度的依据是什么?

正常人血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可获得5条区带。

γ-球蛋白的等电点约为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢。

而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3，在电场中比γ-球蛋白移动速度快。

其中清蛋白等电点为4.88，带负电荷最多，速度最快。

且清蛋白在血清中含量最多。

所以离点样线最近的是γ-球蛋白，离点样线最远的最粗的线是清蛋白。

血清的电泳图谱上，从正极端开始分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

对比血清的电泳图谱与样品的电泳图谱上区带的位置，可知样品中含有哪种蛋白。

经纯化后的清蛋白和γ-球蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳图谱上，若仅在清蛋白和γ-

球蛋白位置上出现区带，说明纯度高；若在其它蛋白位置上出现区带，说明纯度低，含有杂蛋白