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实验利用正交试验优化最适培养基
实验 利用正交试验设计选择和优化最适培养基
一、实验目的
1.掌握单正交试验选择微生物最适发酵条件和培养基的基本方法;
2.掌握微生物摇瓶发酵实验的基本操作技术;
3.初步掌握用正交表试安排试验及对实验结果进行分析的方法。
二、实验原理
对于一个生物作用过程,其结果或产物的得到受到多种因素的影响。
如发酵中,菌种接入量、酶的浓度、底物浓度、培养温度、pH值、菌种生长环境中的氧气、二氧化碳浓度、各种营养成分种类及其比例等。
对于这种多因素的实验,如何合理地设计实验,提高效率,以达到所预期的目的是需要进行认真考虑和周密准备的。
正交实验法是安排多因素、多水平的一种实验方法,即借助正交表的表格来计划安排实验,并正确地分析结果,找到实验的最佳条件,分清因素和水平的主次,这就能通过比较少的实验次数达到好的实验效果。
现以灰黄霉素产生菌D-756为例,研究不同氯化物浓度及大米粉配比对灰黄霉素产生菌D-756变种发酵特性的影响。
试验共三个因素,每个因素取三个水平。
1.确定试验的培养基组成成分(因素)和每种组成成分的含量(水平)
影响试验指标的因素很多,由于试验条件的限制,不可能逐一或全面地加以研究,因此要根据已有的专业知识及有关文献资料和实际情况,固定一些因素于最佳水平,排除一些次要的因素,而挑选一些主要因素。
正交试验设计法正是安排多因素试验的有利工具。
当因素较多时,除非事先根据专业知识或经验等,能肯定某因素作用很小而不选取外,对于凡是可能起作用或情况不明或看法不一的因素,都应当选入进行考察。
因素的水平分为定性与定量两种,水平的确定包含两个含义,即水平个数的确定和各个水平数量的确定。
对定性因素,要根据试验具体内容,赋予该因素每个水平以具体含义。
定量因素的量大多是连续变化的,这就要求试验者根据相关知识或经验、或者文献资料首先确定该因素的数量变化范围,而后根据试验的目的及性质,并结合正交表的选用来确定因素的水平数和各水平的取值。
每个因素的水平数可以相等,也可以不等,重要因素或特别希望详细了解的因素,其水平可多一些,其他因素的水平可以少一些。
如果没有特别重要的因素需要详细考察的话,要尽可能使因素的水平数相等,以便减小试验数据处理工作量。
表—试验因素和水平
因素
水平
KCl%
NaCl%
大米粉%
1
0.5
0.4
9
2
0.7
0.6
11
3
0.9
0.8
13
2.制定因素水平表
根据上面选取的因素及因素的水平的取值,制定一张反映试验所要考察研究的因素及各因素的水平的“因素水平综合表’’。
该表在制定过程中,对于每个因素用哪个水平号码,对应于哪个量可以随机地任意确定。
一般讲最好是打乱次序安排,但一经选定之后,试验过程中就不能再变了。
3.选用合适的正交表
根据参与试验的因素水平数和客观条件选用适当的正交表,若每个因素都2水平,应选用二水平正交表,及L4(23);都取3水平,应应选用三水平正交表,如L9(34);若因素间水平不等可选用混合水平型正交表,即L18(2×37)等。
对于同类正交表,考虑交互作用时,应选大的正交表;已知因素间交互作用小的或不考虑交互作用的,可选用小的正交表。
L9(34)正交表
列号
试验号
1
2
3
4
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
4.列出试验方案(表头设计)
把各列按照表头设计排上培养基组成成分,各列对应的水平数字换上各组成成分所对应的实际水平,每一行就构成一个处理(一个培养基配方的主要成分),各个培养基配方便组成整个试验方案。
因子
试验号
1
A
KCl
2
B
NaCl
3
C
大米粉
4
1
1(0.5)
1(0.4)
1(9)
1
2
1(0.5)
2(0.6)
2(11)
2
3
1(0.5)
3(0.8)
3(13)
3
4
2(0.7)
1(0.4)
2(11)
3
5
2(0.7)
2(0.6)
3(13)
1
6
2(0.7)
3(0.8)
1(9)
2
7
3(0.9)
1(0.4)
3(13)
2
8
3(0.9)
2(0.6)
1(9)
3
9
3(0.9)
3(0.8)
2(911)
1
5.实施实验方案
根据所定试验方案,按照规定试验内容,以常规操作制备培养基。
一般一个培养基要重复2-4瓶。
各个培养基应采用同一细胞浓度的菌悬液接种,以相同转速摇瓶培养3天,测定产物活性,最后按照正交表进行实验结果的统计分析。
在整个方案实施过程中要精心操作,试验条件尽量力求一致,以便取得正确的合乎实际的试验结果。
6.正交试验结果分析
正交试验结果的直观分析与正交试验结果的方差分析相比,具有计算量小、计算简单、分析速度快、一目了然等特点,但分析结果的精确性与严密性相对于方差分析来说稍差。
直观分析步骤如下:
行号\因素
1
A
KCl
2
B
NaCl
3
C
大米粉
4
空列
效价yi
平均
1
1
1
1
1
13258
13490
13374
2
1
2
2
2
13672
14100
13886
3
1
3
3
3
14893
14923
14908
4
2
1
2
3
13765
13920
13843
5
2
2
3
1
14798
14671
14735
6
2
3
1
2
14926
15000
14963
7
3
1
3
2
14111
14412
14262
8
3
2
1
3
13986
14025
14006
9
3
3
2
1
15270
15089
15180
K1
42168
41478
42343
43288
A2B3C3
RB>RC>RA
K2
43540
42626
42908
43111
K3
43447
45051
43904
42756
k1
14056
13826
14114
14429
k2
14513
14209
14303
14370
k3
14482
15017
14635
14252
R
457
1191
521
177
(1)计算K值
其中,以A因子为例:
K1=y1+y2+y3=42168 A因子1水平的3个试验结果之和;
K2=y4+y5+y6=43540 A因子2水平的3个试验结果之和;
K3=y7+y8+y9=43447 A因子3水平的3个试验结果之和;
k1=K1/3=14056
k2=K2/3=14513
k3=K3/3=14482
R=k[max]-k[min]=k2-k1=14513-14056=457 称为极差
对于B、C因子,依次类推。
(2)作用因素与试验结果的关系图
以因素的不同水平作横坐标,以k值作纵坐标,把每个因素不同水平与所对应的k值作曲线图。
(3)判断各因素主次关系及其显著性
根据极差R的大小,可判断各因素对试验结果影响的大小。
判断的原则是:
凡是R越大,所对应的因子越重要。
根据图表可知,第二列的极差最大,为1191,所以B因素(NaCl)对试验结果的影响是最主要的。
影响度依次为B(NaCl)→C(大米粉)→A(KCl)。
对于空列来说三个因素的极差本应为零。
但是在实际实验中,总是有误差的,极差不能正好为零。
它的大小正好反映了误差的大小。
本例中三个因素的极差都比空列的极差大的多,说明这三个因素的影响都是显著的。
(4)确定优水平组合:
根据k1、k2、k3值的大小来确定A、B、C各因子取决于哪个水平好。
确定的原则根据对指标值的要求而定:
如果要求指标值越大越好,则取最大的k所对应的那个水平;如果要求指标值越小越好,则取最小的k所对应的那个水平。
本例中根据图表可知,我们要求NaCl和大米粉浓度越大越好,KCl浓度取0.7%时最好;因而,选择A2B3C3,即得到一个好条件,即:
KCl0.7%,NaCl0.8%,大米粉13%。
这个组合是在原试验方案中没有做过的。
由此可见,利用正交设计,其最优处理组合即使没有做过,也能计算出来,作为参考。
三、材料和方法
菌种:
大肠杆菌Escherichiacoli
发酵基础培养基:
见实验内容。
四、实验方法
本实验运用正交法测定将葡萄糖作为碳源,蛋白胨、酵母膏作为氮源,KH2PO4为磷源对Escherichiacoli生长的影响,并求得各营养物在什么样的配比时生物量最大。
通过本实验初步掌握正交法的使用。
(一)单因素发酵条件实验(略)
1、不同碳源对发酵的影响:
基础培养基:
(NH4)2SO4 0.3%,KH2PO4 0.2%,MgSO4 0.05%,分别加入4%不同碳源。
2、不同氮源对发酵的影响:
基础培养基:
碳源 4%,KH2PO4 0.2%,MgSO4 0.05%,分别加入不同氮源pH7.2。
3、不同无机盐对发酵的影响:
基础培养基:
碳源 4%,氮源 0.3%,MgSO4 0.02%,pH7.2,分别加入不同量无机盐。
(二)正交实验——最佳发酵培养基的确定
将以上因素实验的结果综合起来,还不能认为是最佳条件,特别是在碳、氮源、无机盐的用量上,必须通过正交实验和验证实验才能确定最佳配方。
本实验中的无机盐类中,MgSO4影响不大,而KH2PO4起着决定性作用,因素采用三因素三水平的正交设计。
因素
水平
葡萄糖%
蛋白胨%
KH2PO4%
1
2
3
1)确定试验的培养基组成成分(因素)和每种组成成分的含量(水平)
2)进行表头设计
3)配制培养基:
按照试验设计方案,分别配制不同培养基,250ml三角瓶每瓶装量50ml,121℃灭菌20分钟。
4)接菌、摇瓶培养:
将活化菌种接种到新鲜的LB培养基中过夜,再按1%接种量转接到不同的培养基中,37℃下180rpm/min摇床振荡培养24hr。
5)菌体量测定:
离心收集菌体,用无菌水悬浮并作适当稀释,在660nm下测浊度。
6)数据记录及分析:
把测定数据填入分析表的试验结果栏内,按表中数据计算出各因素的一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水下试验结果总和,再取平均值(各自被3除)。
最后计算极差。
从极差的大小确定那个因素对酶活力影响最大,那个影响最小。
找出在何种条件下生物量最高。
7)以k值为纵坐标,因素的水平数为横坐标,作作用因素与试验结果的关系图。
最后作一直观分析的结论。
表1.因素水平表
因素
水平
ABC
碳源%氮源%KH2PO4
1
2
3
表Ⅱ 表头设计
列号
试验号
1(A)2(B)3(C)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
(2)1(0.3)1(0.2)
12(0.5)2(0.3)
13(0.7)3(0.4)
2(5)12
223
231
3(8)13
321
332
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- 实验 利用 正交 试验 优化 培养基