DNA提取方法和试剂作用.docx

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DNA提取方法和试剂作用

DNA提取方法和试剂作用

1试剂的作用

氯仿的作用？

氯仿：

克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：

去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：

减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

2DNA提取分为三个基本步骤

每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。

方法有三种;①机械方法：

超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：

用SDS处理细胞;③酶解法：

加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。

将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

DNA提取的几种方法

（1）.浓盐法

A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.

B.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.

两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。

在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中

建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。

1.4玻璃颗粒吸附法

在该法中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。

不仅玻璃颗粒可以与DNA进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA的提取方法。

Pichler等[2〕在从抹香鲸（Physetermacrocephalus）牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。

Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化DNA。

很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。

等[4]就探讨了采用Gibc。

公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。

1.5三乙醇胺月桂基硫酸盐（TLS）法

由于常规方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。

TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA的结合，进一步的纯化可采用常规方法。

1.6临床病理标本的DNA提取方法

由于PCR技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。

近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。

对于从这些病理标本中提取DNA的方法研究也很多。

一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。

近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法〔s〕去除包埋的石蜡，使用SephadexG-5。

柱色谱或盐析法[s7等去除蛋白质。

高文涛[71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂（ChelatingResin，亚氨基二乙酸）提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。

Coombs等〔s〕则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。

1.7盐析法

该法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。

谭建明等[9]对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。

该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。

2植物来源的DNA提取

利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组总DNA的制备，不同植物的核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。

由于植物中次生代谢产物—多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。

因此要从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组DNA也并非易事[11l。

目前采用的方法有以下几种。

2.1十六烷基三乙基澳化按（CTAB）法

CTAB是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。

在该法中使用的聚维酮（PVP）与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解[121。

王卓伟等[13〕在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVI〕还能有效地去除多糖。

罗志勇等[14〕在研究中对这种方法进行了几点改进:

①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中琉基乙醇的含量，同时加人PVP使其与多酚类物质结合形成复合物;③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。

用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA,Porebski等[1s]在沉淀粗提DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5mo卜L-’以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。

Stein等[16]对传统的CTAB法进行了优化，创建了一种从新鲜草本植物样本中提取DNA的方法。

首先在特制的有96个孔的托盘上种植植物样本，并依照不同样本在托盘中的位置进行编号，然后取适量植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中，除去袋中的空气并封口，再用特制的手工匀化器将各袋中的样本混匀，56`C孵育1h后将袋中的液体取出进行离心以及DNA的沉淀。

Xin等〔17〕则采用简易的96孔托盘作为提取时的容器，将多种植物样本经研磨处理后分别放在不同的孔中进行提取，在一天内由一人就可完成上千个样本的DNA提取，为高通量植物基因分析及筛选提供了极大的便利。

2.2SDS法

为了避免CTAB法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDSTris-Cl--EDTA等直接裂解细胞使其释放出DNA的方法]。

在该法后续的DNA纯化过程中通常采用酚/氯仿处理，但对于植物DNA纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低DNA的提取效率和纯度。

在用该法提取DNA的过程中采用较大的离心力和较长的离心时间，然后用氯仿一异戊醇代替酚来去除变性蛋白质，从而克服了由于酚的掺人及残留对以后酶切带来的困难。

用琉基乙醇代替SDS，对大豆DNA分离提取能够更有效地去除蛋白质，而且可以有效防止褐变，获得天然双链高分子量的DNA产物，并且减少了SDS对PCR、随机扩增多态性DNA技术（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）等操作的影响。

在对辣椒DNA进行提取时为了提高DNA的产率将待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且针对辣椒叶子中多酚类物质极少的特点将其中的加人PVP的步骤省去，消除了PVP对以后操作的影响.

2.3氯化千法在对称猴桃的基因组DNA提取过程中选用了氯化节法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能是氯化节不仅可与植物细胞壁上的多糖经基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的All基反应，起到破坏糖链的作用，利于DNA的释放和提纯。

2.4高盐低pH法

该法中所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。

通常采用的无机盐为醋酸钾，低pH的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。

与一般氯仿一异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比该法操作更方便省时，所需样品量少，适用于

濒危植物DNA的提取。

2.5果胶酶法

Steven等[2s采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理使与DNA共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与DNA一起沉淀下来，降低了DNA的纯化难度，提高纯化效率。

3微生物来源DNA的提取

常规的微生物DNA提取多是根据某种微生物的具体特点选择合适的方法。

在实际的科学研究过程中，很多科学工作者通过实践总结出许多快速实用的提取方法，现择其中比较典型的加以总结。

3.1细菌质粒的提取方法

质粒是独立于细菌染色体DNA之外的环状DNA，它能携带外源基因进人细菌进行扩增，或表达外源基因，是基因工程中常用的载体，在DNA重组技术、DNA测序、转基因等方面具有广泛的应用。

对于细菌质粒的提

取比较经典的方法有:

碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。

这些方法的选择取决于质粒的大小、细菌菌株的性质等。

Keunosky等GE_发展了一种以Zn'+诱导DNA沉淀的方法，在该法中利用一定浓度的ZnCl:

溶液使一定体积的细菌菌液质粒DNA大量沉淀，无需多次离心，大大简化了抽提的步骤。

近年来，一些生物技术公司，比如Promega公司及Qiagen公司等纷纷推出质粒抽提试剂盒，这些试剂盒多运用树脂材料或硅胶来特异性的吸附质粒DNA，提取过程用时少，效率高。

3.2真菌DNA提取方法

对真菌DNA的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性的物理破壁法。

在这两种方法中酶解破壁法较为简单，易于操作和控制，而物理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大量破损。

在提取获得核酸一蛋白质复合物后，对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯仿一异戊醇沉淀法或高盐沉淀法。

韩利刚等C25用CTA13法直接从丝状真菌的新鲜菌丝中提取DNA，并将所提取的DNA进行RAPD，得到了较清晰的扩增图谱。

Loeffler等[Z6为满足快速灵敏准确的临床检验的需要，利用MagNAPureLC系统建立了一种实用的快速提取方法，该法自动化程度高，避免了可能的交叉污染。

Manian等[z7〕在对真菌进行DNA抽提时采用几个循环的快速制冷、煮沸以破碎真菌细胞壁，并通过Qiagen公司的QIAquickDNA纯化柱，迅速从极微量的真菌中获得高纯度的D