基因工程原理与技术思考题.docx
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基因工程原理与技术思考题
ChapterIIntroduction
基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。
①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。
③基因是可以转移的。
④多肽与基因之间存在
对应关系。
⑤遗传密码是通用的。
⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。
geneticengineering遗传工程
geneengineering基因工程:
通过基因操作,将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转
入目标生物获得新的遗传性状的操作。
genemanipulation基因操作:
对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移
等操作的总称。
recombinantDNAtechnique重组DNA技术
genecloning基因克隆:
是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程,其目的在于获得
大量的基因拷贝,在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大
繁殖等环节。
molecularcloning分子克隆
否,密码子简并性
医学:
人胰岛素和疫苗
农业:
抗虫BT农药
工业:
工程酿酒酵母
2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些P12-14?
简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些
p14?
同裂酶:
识别位点、切割位点均相同,来源不同。
在载体构建方面往往可以取得巧妙的
应用。
应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1,它们均识别CCCGGG,但前者切后产生
钝末端,后者切后产生粘性末端
(isocaudomer)产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来
的。
活性?
P17-18
'-OH末端,催化核苷酸的聚合作用。
①依赖于DNA的DNA聚合酶
②依赖于RNA的DNA聚合酶
8)
逆转录酶:
RNA指导的DNA聚合酶,
Klenow片段的特性和用途有哪些?
举例说明。
p17
限制酶所切割。
两者的两端均具有相
5‘P以抑制
质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率?
目的基因片段与载体由相同的单一限制性核酸内切酶消化酶切后,同的黏性末端,成为单酶切位点的黏性末端。
①为了防止载体的自我环化,通常用碱性磷酸酶去除载体的粘性末端的
DNA的自我环化。
定向连接重组,以便定向克隆。
决?
Chapter川Hostandvectors
质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体
克隆载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。
表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。
种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
①具有复制子,能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。
②具有合适的限制性内
切酶位点。
③具有合适的选择标基因。
④具有较多的拷贝数,易于宿主细胞的染色体DN分开,便于分离提纯。
⑤具有较小的相对分子质量,易于操作。
4)
什么是质粒?
质粒分哪几种?
有哪两种复制类型,质粒的分子生物学特性有哪些?
质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。
严紧型和松弛型。
①不亲和性②转移性
①共价闭合环状DNA^开环DN③线性DNA
不亲和性:
两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存。
转移性:
质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒和非接合型质粒。
接合型质粒:
相对分子量大,除了携带自我复制遗传信息外,还带有一套控制细菌和质
粒接合转移的基因,严紧型质粒。
非接合型质粒:
相对分子量小,不能携带接合转移基因。
①具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。
②具有多个单一限制性内切酶酶切位
点。
③具有两种以上标记基因。
④具有安全性。
程载体?
该如何改造?
p28
插入型和取代型基因组大而复杂
a-互补:
指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的
3-半乳糖苷酶(B-galactosidase,由1024个氨基酸组成)阴性的突变体之间实现互补。
a-互补是基于在两个不同的缺陷3-半乳糖苷酶阴性的突变体之间可实现的功能互补
而建立的。
将缺失编码第11-41位氨基酸的3-半乳糖苷酶基因称为lacZ△M15基因而
将半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和编码3-半乳糖苷酶N端140个氨基酸的序列称
为lacZ'.这两个基因的产物单独存在时都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性所以在载体上加lacZ'/(MSC),并在受体菌中引入lacZ△M15即可实现a-互补.IPTG是
lac操纵子的诱导物,底物X-gal被3-半乳糖苷酶分解后可以产生蓝色.如果质粒载体中插入了外源DNA,lacZ'的产物则不能与lacZ△M15基因的产物实现a-互补,在IPTG
诱导下不能产生有活性的3-半乳糖苷酶,菌落便不可能呈现蓝色。
白色菌落便是含有
插入了外源DNA的重组质粒。
因此可利用菌落颜色变化来筛选插入外源DNA的重组质
一个带有大肠杆菌3-半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的入载体转入
lac"的宿主菌后,在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D-半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的
噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
什么叫插入失活,举例说明之。
名称
来源
特点
用途
M13噬菌体载体
M13mp1是构建的第一个M13噬菌体载体,随后构建的一系列
M13载体都是在此基础上经改建派生出来的。
可用来克隆具有不同限制末端的外源DNA片段,而且克隆
片段插入方向是固定的。
1.可以制备单链
DNA进行DNA序列分析。
2.可以制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。
3.可以在寡核苷酸介导的基因定点突变来制备含有目的基因的单链
DNA模板。
黏粒载体(cosmidvector)
先用特定的限制性核酸内切酶局部消化真核生物的DNA,产生出高相对分子质量的外源DNA片段,与经同样的限制性核酸内切酶切割过的黏粒载体线性DNA分子惊醒体外连接反应。
1.具有入噬菌体的体外包装、高效感染特性。
2.具有质粒载体的易于克隆操作。
3.具有高容量的克隆能力。
4.具有与同源序列的智力进行重组的能力。
可以克隆外源DNA分子比较大的。
酵母人工染色体
由酵母的自主复制序列、着丝粒、四膜虫的端粒、以及酵母的选择性标记组成的能自我复制的酵母线性克隆载体。
目前克隆最大DNA
片段的载体。
目前克隆最大DNA片段的载体。
细菌人工染色体
以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。
除去了F因子的转移去及整合区等非复制必须片段,并引入了多克隆位点及选择标记BAC克隆容量可以达到300kb.
可用于真核生物重
要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。
ChapterIVThetechnicalprincipleofgeneticmanipulation
2)
分离纯化质粒的方法有哪几种?
简述CsCI密度梯度分离法、碱变性法的原理,如何选择
合适的分离方法?
什么是DNaseI足迹实验?
简述其基本原理?
ChapterWObtainingoftargetgene
2)
什么是基因文库?
简述构建基因文库常用的载体有哪些?
3)
什么是基因组文库?
简述构建基因组文库的一般步骤?
隆基因?
Ti质粒的结构特点?
Ti质粒介导植物基因转移的过程?
ChapterIXScreeningandidentificationofrecombinantclones
1)
如何从所克隆到的基因重组载体中鉴定目的基因的存在和正确性
4)
隆?
简述根据载体表型特征进行重组子筛选的常用方法及其基本原理?
几种?
ChapterXExpressionofcloninggene1)大肠杆菌作为基因工程受体菌有哪些优缺点?
2)
实现真核基因在大肠杆菌表达系统的正确表达需要哪些基本条件?
5)
可使外源基因在大肠杆菌中高水平表达的启动子应具备哪些条件?
6)
常用大肠杆菌表达载体有哪些?
简述入PL启动子表达载体和T7噬菌体RNA聚合酶/启
动子表达载体的主要特征?
8)
在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体需具备哪些条件?
9)
利用大肠杆菌进行外源蛋白质主要有哪几种表达部位?
采用相应表达形式有何优缺
点?
12)
13)
从提高转录启动效率及翻译起始效率角度考虑,可通过哪些措施构建高效率表达载体,
提高外源基因表达效率?
避免外源基因表达蛋白被宿主细胞内源蛋白水解酶降解的主要措施有哪些?
15)
17)
与原核细菌相比,酿酒酵母做为外源基因表达受体菌有哪些优点?
酵母表达系统有哪些优缺点?
酵母基因表达系统主要有哪些基本结构?
常采用的选择标记基因有哪些?
21)
酵母菌的蛋白修饰分泌系统有哪些功能?
对外源基因的蛋白表达有何作用?
根据课堂讨论题目扩增思考题目
3)
转基因动物的概念,显微注射法制备转基因动物的主要过程
4)
何谓动物克隆技术?
有何应用价值?
5)
转基因植物有哪些应用价值?
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- 基因工程 原理 技术 思考题