细胞实验的基本操作.docx
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细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作
【细胞培养】
一、细胞的复:
非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中,需要培养时要先从液氮中取出使之复。
细胞复的原则——快速融化:
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
具体操作如下:
1、实验前准备:
1.1、将水浴锅预热至37℃,并将含10%FBS的培养液置于其中预热;。
1.2、用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管与迅速解冻:
2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,约1-2min后冻存管液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中,1000~1500rpm离心3分钟;
4、制备细胞悬液吸去上清液,加入10ml培养液,用吸管轻轻吹打均匀,使细胞悬浮;
5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱培养(略微拧松培养瓶盖),换液的时间由细胞情况而定。
通常,除少数特别注明对DMSO敏感的细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,可直接放入含有10-15ml(5-10倍)新鲜培养基的培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代:
培养的细胞生长至一定密度之后,由于培养液中营养逐渐消耗、代物逐步积累(可见到培养液变黄),而且细胞的生长空间也受到限制,就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液,这一过程就叫做传代。
1、贴壁细胞的传代
具体操作如下:
1.1、传代前准备:
1.1.1、预热培养用液:
把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅预热。
1.1.2、用75%酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台
1.1.3、正确摆放使用的器械:
保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
1.1.4、点燃酒精灯:
注意火焰不能太小。
1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。
1.1.6、取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台。
1.1.7、从培养箱取出细胞,注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察
细胞,并做好记录。
1.1.8、细胞培养瓶经用75%酒精擦拭后,再放入超净台。
1.2、胰蛋白酶消化:
1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后,打开瓶盖,靠近酒精灯,小心吸出旧培养液,用PBS清洗2-3次,沿
壁(无细胞的一面)缓缓加入适量消化液(胰蛋白酶液),轻轻摇晃。
注意消化液的量以盖住细胞最好,最
佳消化温度是37℃。
1.2.2、显微镜下观察细胞:
倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时
细胞消化适度。
1.3、吹打分散细胞:
1.3.1、弃去大部分消化液(仅留少量在瓶),并轻轻拍打培养瓶,使细胞分散,然后加入新鲜的培养液,
再用吸管轻轻吹打成细胞悬液(尽可能不要出现泡沫,否则对细胞有损伤〕
1.4、分装稀释细胞
1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量,必要时计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应
该不低于5×105/ml。
最后在瓶上做好标记,如细胞代数、日期与等。
1.5、继续培养:
1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在
瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。
2、悬浮细胞的传代
悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉,只留下少量,然后加入新鲜培养液即可。
当细胞悬液中碎片或颗粒物较多,感觉到比较脏时,可以将悬液移到离心管,1000~1500rpm离心3分钟,弃上清,加入约2ml培养液,吹打至均匀,滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。
然后置于二氧化碳培养箱中培养(拧松培养瓶盖)。
三、细胞的冻存
细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温,以避免细胞部形成冰晶对细胞造成伤害。
1、具体操作如下:
1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存,但最好选择对数增长期细胞,已长满的细胞冻存复后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
1.2、贴壁细胞经消化、离心(1000~1500rpm,5min)收集,悬浮细胞经离心收集;
1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液(10%DMSO+90%血清),用吸管吹打,使细胞分散成单细胞悬液;
1.4、加入到冻存管中,每个冻存管加1-1.5ml的细胞悬液;密封;
1.5、在冻存管上标明细胞名称与冻存日期;
1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒,管置于4℃半小时,然后置于-20℃两小时,再置于-70℃两小时,然后置于液氮上方过夜;第二天将细胞置于液氮中;
1.7、记下冻存管存放的位置,作好冻存记录(冻存的细胞名称、代数、冻存日期等)。
2、注意事项:
2.1、使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构,以
至于降低冷冻保护效果。
在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最好戴上手套操作。
2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度围过久,低温损伤主要发生在这一温度区,是“危
险温区”。
2.3、注意定期检查液氮罐液氮量,与时添加。
2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。
但为妥善起见,特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存
后要在短期复一次,观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复一次后,再继续
冻存。
四、细胞计数
实验原理:
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作如下:
1、准备工作:
取一瓶传代的细胞,按上述二的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以使用。
2、细胞悬液制备:
细胞悬液的制备方法:
用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测单细胞悬液。
3、细胞计数:
2.1、盖好盖玻片:
取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.2、制备计数用的细胞悬液:
用吸管吸适量细胞悬液(如5滴)到一离心管中,加入等体积台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
若仅是单纯的进行细胞计数,不考虑细胞的活力,则可省略台盼蓝染色步骤。
2.3、、将细胞悬液滴入计数板:
将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
2.4、统计四个大格的细胞数:
将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
2.5、计算原细胞悬液的细胞数:
按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×2×104
说明:
公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:
1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3;而1ml=1000mm3
细胞计数要点:
①进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培
养液中;
②要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
③取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
④数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
⑤操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
注:
4%台盼蓝母液的配制:
称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
使用时,用PBS稀释至0.4%。
五、细胞活力的测定
1.染料排斥试验:
其原理是细胞损伤或死亡时,某些染料可穿透细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色。
而活细胞则能阻止该染料进入细胞。
借此可鉴别死细胞和活细胞。
常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。
以台盼蓝染色为例。
步骤同上述细胞计数的操作步骤。
注意以下几点:
①计数:
在3-10min,用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(死细胞被染成淡蓝色,活细胞则拒染)。
②台盼蓝染色时,时间不宜太长,否则活细胞也会着色,从而干扰计数。
③活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%
2、MTT比色实验:
可测定测药物或病毒的IC50
原理:
活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT),还原成紫色不溶性结晶物,沉积于细胞中。
用酸性异丙醇或DMSO溶解后,于酶标仪上测定光吸收值。
紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态相关。
2.1、将细胞接种于96孔板上,密度为大约105个/ml,每孔接种100μl;
2.2、培养至对数生长期加入待测样品;
2.3、作用一定的时间之后,加入三蒸水配制的5μg/ml的MTT溶液,每孔20μl;
2.4、37℃温育4小时;
2.5、取出培养板,小心吸去上清,注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀;如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清;
2.6、每孔加入100μl的DMSO,摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解;
2.7、用酶联免疫检测仪(DNAExpert)在595nm(或490nm)波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值
(OD值),按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的抑制率:
细胞存活率(%)=治疗组OD值/对照组OD值×100%
2.8、求出各药物(或病毒)浓度下的OD值占对照OD值的百分比,用此百分比对药物(或病毒)浓度作图;
在所得的曲线上,百分比值为50时所对应的浓度就是IC50值。
或根据各浓度下细胞的存活率,采用Logit
法计算IC50。
六、细胞的运输
装运细胞的方法有两种:
1、冷冻贮存运输
即利用特殊盛液氮或干冰冻存,保存效果较好,但较麻烦,且不能长时间运输,多需空运。
2、充液法
2.1、选生长状态良好的细胞,去掉培养液,充满新培养液,液量要达到培养瓶颈部,拧紧螺帽或塞以胶塞,
保留微量空气。
若空气留量过多,运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。
2.2、妥善包装、运输。
一般在四五天到达目的地,对细胞活力无多大影响,时间过长则细胞活力下降。
2.3、到达目的地后,倒出大部分培养液,保留维持细胞生长所需的液量,置37℃培养,次日传代。
注:
从其他研究室所取细胞时,应注意了解细胞的性状、培养液、培养时的注意事项等
【细胞转染】
一、脂质体转染(Lipofetmiane2000)
1、转染前细胞的处理(以24孔板培养为例):
贴壁细胞:
在转染前一天,在24孔板铺上0.5×105细胞,500ul无抗生素培养基培养一天,到转染时使细胞达到80%~90%的汇合率。
悬浮细胞:
在制备混合物前,将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板。
2、转染方法(以质粒DNA转染为例)
2.1、将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti-MEMⅠReducedSerumMedium中。
混合均匀。
2.2、将适量Lipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti-MEMⅠ中,混合均匀。
在室温下孵育5分钟(在25分钟进行步骤c)。
2.3、孵育5分钟后,将上述两种混合物混合(总体积100ul)。
轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟(可能出现雾状沉淀)。
复合无在室温下六小时稳定。
2.4、在24孔板中每孔加入100ul的复合物以与适量培养基。
十字法混合均匀。
2.5、细胞在37。
CCO2培养箱中培养18-48个小时后,测量转染效率。
在加完复合物4-6小时候可更换培养基。
3、转染注意事项
3.1、转染严格来说,每种细胞的条件是不一样的,如果实验时,不能确定最佳转染条件,请在细胞实验组共享文件夹查找类似细胞的转染方法;
3.2、转染结果的好坏,与DNA质量密切相关,务必在实验之前对去毒素质粒DNA的质量进行严格鉴定,至少采用以下两种方法:
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,如果有条件,可对质粒DNA去毒素质量的进行检测。
细胞相关实验操作方法
【小量细胞样品TotalRNA的提取方法】
一、实验步骤(以细胞为例)
1.1、细胞样品(1.0×107个)去上清之后,加入1mlTRIzol溶液反复吹打至溶液清亮,转移入1.5mlTube中室温下放置10min,如不能立即提取则放于-80℃保存(可保存一个月),提取时取出放于室温融化;也可按照正常冻存方法保存1×107个细胞,提取时37℃迅速融化,5000rpm离心3min去除上清液后迅速加入1mlTRIzol溶液反复吹打至溶液清亮,室温下放置10min;
1.2、加入200ul氯仿(1/5TRIzol体积),先用枪混匀10-15下,再充分颠倒混匀2min,使两相充分混合,室温静置3min;
1.3、4℃、10000g(12000rpm)离心15min;
1.4、小心吸取上清(中间有厚厚的蛋白层)至一新的1.5mlTube中(可取干净),加入0.5ml异丙醇(1/2TRIzol体积)先用枪混匀10-15下,再充分颠倒混匀2min,室温放置10min;
1.5、4℃、10000g(12000rpm)离心10min;
1.6、小心吸去上清液(注意不要吸起白色沉淀),加入1ml70%乙醇(-20℃预冷)旋转漂洗RNA沉淀;
1.7、4℃、10000g(12000rpm)离心5min;
1.8、小心吸去上清液,空气中干燥2-3min,加入84ulDEPC水充分溶解RNA(如溶解困难,4℃放置过夜);[将RNA稀释5倍,电泳,]
(若是对RNA的质量要求不高,做到这一步即可,以下是纯化的步骤)
依次加入2ulRNaseInhibitor〈40U/ul〉,10ul10×DNaseIBuffer,4ulDNaseI〈RNaseFree〉〈5U/ul〉,充分混匀后37℃反应60min;
1.9、补加200ulDEPC水至总体积300ul,再加入300ulPCI(DEPC水饱和),充分混匀5min,室温10000g(12000rpm)离心10min;
1.10、小心取上清(几乎看不见中间层,取的较干净)于一新的1.5mlTube中,再加入300ulCI,充分混匀5min,室温10000g(12000rpm)离心10min;
1.11、小心取出上清液(几乎看不见中间层,取的较干净)于一新的1.5mlTube中,加入30ul3MCH3COONa充分混匀1min后加入750ul无水乙醇(-20℃预冷),充分混匀2min,-20℃放置40min;
1.12、4℃、10000g(12000rpm)离心15min,小心取出上清(可用枪取干净);
1.13、加入1ml70%乙醇(DEPC水配制)(-20℃预冷),旋转振荡清洗RNA沉淀,4℃、10000g(12000rpm)离心10min;
1.14、小心吸去上清液,室温干燥2-3min,加入80ulDEPC水溶解;
1.15、分别取2ulRNA溶液溶于10ulDEPC水中,混匀后各取出5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳,根据电泳结果判定RNA是否有降解;
1.16、按照电泳结果估计RNA浓度,按比例使用TEBuffer(PH8.0)稀释到0.3至0.5OD吸光度围;
二、实验注意事项
1.1、整个实验过程中应该使用橡胶手套和口罩,实验前,使用70%乙醇擦拭双手和工作台以与实验用品;
1.2、实验用试剂必须保证质量,对pH值有要求的必须以灭菌后的测量值为准;
1.3、贵重的样品,抽完之后,必须取出一定量作为实验室保存;
1.4、必要时,可以将枪头剪掉一部分使用,以免RNA大量断裂。
【PBS溶液的配制使用以与保存方法】
一、试剂用途
实验中主要用来溶解稀释固体试剂,形成含有缓冲体系的盐离子溶液
二、配制,使用和保存方法
1、溶液配制
按1L的标准量配制
称取下列药品:
NaCl8.0g
Na2HPO41.15g
KCl0.2g
KH2PO40.2g
溶解、定容,使用实验室用超纯水;
2、除菌
实验室采用过滤灭菌,使用0.22μm的除菌膜;
4℃保存。
3、使用
使用过程中应该保证严格的无菌操作,为了防止污染,可用50ml无菌离心管对dPBS进行分装。
【抗生素配制使用以与保存方法】
一、原核细胞用抗生素
细胞培养相关实验中,为了防止培养过程中出现细菌污染,需要在培养基中添加双抗,即青霉素和链霉素。
1、药物使用浓度
根据细胞种类的不同,一般(P/S)的终浓度保持在100U/ml,具体的实验过程中,可以根据细胞对抗生素的敏感程度减少或增加双抗用量,原则来说,抗生素的使用围为:
50U/ml-200U/ml。
2、药物配制方法(干粉状的抗生素)
2.1、药物溶解
使用少量的dPBS溶液溶解干粉状的抗生素,溶解过程中,应尽量减少dPBS的用量,使药物保持在较高浓度;
2.2、溶液除菌
使用0.22μm的除菌膜过滤,然后分装,-20℃保存。
2.3、日常使用
按实验要求的终浓度将抗生素溶液添加到培养基当中,注意无菌操作。
2.4、注意事项
①总的原则是现用现配,尽量减少溶液反复冻融次数,防止抗生素失效;
②培养基最好是现用现配,在含有血清的完全培养基中,添加抗生素,应4℃保存且有效使用期不能超过1个月。
③抗生素并非越多越好,在实验细胞条件不明确之前,应该先从最小使用量开始。
二、真核细胞用抗生素
本实验室现在常用的真核用筛选标记物主要有两种:
neomycin(G418)和Puromycin,实验中主要用来筛选细胞稳定株或者阳性细胞群落。
1、药物配制和保存方法如下:
药品保存溶液配制
G418Preparedinahighlybufferedsolution(e.g.100mMHEPES,pH7.3,orcellculturemedium).
本实验室使用dPBS,pH7.3
固体保存:
SHELF(+20°C).Thisproductisstablefor2years
液体保存:
Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22μmor0.45μmmporesizefilter,aliquotandfreeze(-20°C)forlongtermstorageorrefrigerate(+4°C)forshort-termstorage.assupplied.Sterilestocksolutionsarestableforatleast1yearat+4°C.
HygromycinBSterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticinPBS;Sterile-filteredat50mg/mlactiveantibioticin50mMHEPES,PH7.2.本实验室使用dPBS,pH7.3固体保存:
Storageat4℃,isstablefor2-3yearsas
supplied.
PuromycinSolubleinH2O(50mg/ml)ormethanol(20mg/ml)
本实验室使用dPBS,pH7.3
固体保存:
Freezer(-20℃).Protectfrommoisture.Followingreconstitution,sterilizebyfiltrationthrougha0.22umpore-sizefilter,aliquotandfreeze(-20℃).Thisproductisatablefor2yearsassupplied.
液体保存:
Stocksolutionsarestableforupto3months
at-20℃.
2、日常使用注意事项
①实验中,应该首先确认细胞带有抗性;
②总的原则是现用现配,尽量减少溶液反复冻融次数,防止抗生素失效;
③培养基最好是现用现配,在含有血清的完全培养基中,添加抗生素,应4℃保存且有效使用期不能超过1个月。
④抗生素在使用之前,应该对细胞细胞相对于抗生素的敏感性进行预实验,确定药物使用最佳浓度和最佳作用时间,然后开展正式的实验。
【细胞培养基的使用方法】
一、液体培养基产品质量检测
实验室在接到产品时,在正式使用之前,应该进行如下质量检测程序
1、运输条件:
收到培养基之后,先检查运输条件是否合理,正常状况下应该为4℃运输。
2、产品外观:
检查封口是否完好,晃动液体,观察溶液是否澄清,正常情况下,溶液应该是澄清,均一的。
3、污染物检测:
一般在无菌条件下,取5ml培养基于6cm细胞培养皿,于CO2培养箱中条件进培养96小时,定期检查溶液是否边浑浊,正常情况下,溶液应该是始终澄清均仪的。
二、完全培养基的配制和使用
1、完全培养基的配制
通常状况下,在购买的培养基溶液里添加胎牛血清,抗生素,特殊营养成分等,形成完全培养基。
实验室采用的标准如下:
FBSP/S谷胺酰氨G418Puro
RMPI164010%(体积)100U/ml含有500ng/μl300ng/μl
DMEM10%(体积)100U/ml含有500ng/μl300ng/μl
MEM10%(体积)100U/ml含有500ng/μl300ng/μl
F12/K10%(体积)100U/ml含有500ng/μl300ng/μl
说明可变可变可变可变可变
2、完全培养基的污染物检测
一般在无菌条件下,取5ml培养基于6cm细胞培养皿,于CO2培养箱中条件进培养96小时,定期检查溶液是否边浑浊,正常情况下,溶液应该是始终澄清的,实验中,可能会观察到部分絮状物,这个可能是血清中含有的蛋白变性引起的,和实验选择血清的质量密切相关。
3、在处理细胞的过程中,应该保证严格的无菌操作,使用之前,最好进行37℃预热。
4、完全培养基配好之后,尽量与时使用,平时4℃保存。
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