离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响精.docx
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离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响精
离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响
屠军波1,杨壮群1,姚天华2,赵小鸽3
(西安交通大学:
1.口腔医学院口腔颌面整形外科;2.口腔医学院中心实验室,陕西西安 710004;
3.医学院生物医学实验中心,陕西西安 710061
摘要:
目的 观察神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF对离体培养条件下的人头皮毛囊生长的影响。
方法 在离体人头皮毛囊培养模型中,加入100μg・L-1的NGF,测量毛囊长度的变化以及24hDNA合成率。
结果 目镜测
微器观测100μg・L-1
的NGF与125mg・L-1
的米诺地尔一样能明显地促进游离的人头皮毛囊生长(P<0.05,尤以
前8d较为明显;3H2TdR掺入检测的DNA合成率亦明显增高。
结论 100μg・L
-1
的NGF对游离的人头皮毛囊的生
长有促进作用。
关键词:
毛囊;体外培养;神经生长因子中图分类号:
R322.995
文献标识码:
A
文章编号:
167128259(20040220127203
Effectsofnervegrowthfactoronhumanhairfolliclesinvitro
TuJunbo,YangZhuangqun,YaoTianhua,ZhaoXiaoge(DepartmentofOralandMaxillarySurgery,StomatologicalCollegeof
XiπanJiaotongUniversity,Xiπan710004,China
ABSTRACT:
Objective Toobservetheeffectsofnervegrowthfactor(NGFongrowthofhumanhairfolliclesinvitro.Methods NGFwasaddedtothemodelofhumanhairfolliclesinvitro.ThelengthandtheDNAsynthesisrateofhumanhairfolliclesinvitroweremeasured.Results Wefoundboth100μg・L-1NGFand125
mg・L
-1
minoxidilsignificantlyacceleratedthegrowthofhumanhairfolliclesinvitro(P<0.05,especiallyinthe
previous8days.Therateofincorporationof3
H2TdRwasobviouslyhigherthanthatofthecontrol.
Conclusion
NGFof100μg・L
-1
significantlypromotesthegrowthofhumanhairfolliclesinvitro.
KEYWORDS:
hairfollicle;cultureinvitro;nervegrowthfactor(NGF
收稿日期:
2003205230 修回日期:
2003209226
基金项目:
2002西安交通大学自然科学研究基金;西安交通大学口腔
医院青年科研基金(YQ2001203
作者简介:
屠军波(19722,男(汉族,主治医师,在读博士.
含有色素毛发的生长需要上皮性成份、间质性成份和神经外胚层成份间精密的相互作用来完成。
毛发与神经从起源到分布都提示二者之间有着千丝万缕的联系。
研究发现毛囊中有神经营养因子及其受体的表达,体内实验也发现神经介质对毛囊的生长有一定的影响,特别是近年来基因剔除鼠和转基因鼠的研究进一步提示毛囊的生长存在神经调控机制。
神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF是神经营养因子中有代表性的一种,毛囊中也有其蛋白和受体的表达。
我们构建了游离的人头皮毛囊器官培养模型,观察了NGF对毛囊生长的影响。
1 材料与方法
1.1 标本来源 整形外科除皱头皮和神经外科切口周边头皮(年龄18~45岁。
1.2 培养基与试剂 配制的WilliamsE无血清培养基(Giboco,加入各成份的终浓度分别为:
谷氨酰胺(Sigma2mmol・L
-1
Hepes2mmol・L
-1
氢化可的
松10μg・L-1,转铁蛋白(Sigma10mg・L-1,亚硒酸钠10μg・L-1,牛胰岛素(Sigma10mg・L-1,青霉素10×104U・L
-1
链霉素100mg・L
-1
。
NGF与
米诺地尔购于Sigma公司;3H2TdR购于北京原子能研究所。
1.3 离体人头皮毛囊培养 参照Philpott
1
方法,
在超净工作台中,将头皮于术后尽快取回,清洗消毒后剪成约0.5cm宽的皮条,浸入WillamsE培养基中待分离。
用眼科剪刀将皮条从真皮和皮下组织交界处剪开,以显微外科镊顺毛囊方向将毛囊与周围组织钝性分离,轻轻夹住毛囊远端小心从皮下组织中倒拔毛囊。
注意不要伤及毛乳头和真皮组织鞘,并小心去净毛囊周围的脂肪组织。
解剖显微镜下选取完整无损伤的生长期毛囊进行培养,游离的毛囊小心移入24孔培养板中,每孔1根毛囊,加入0.5mLWillams
第25卷第2期2004年4月西安交通大学学报(医学版
JournalofXiπanJiaotongUniversity(MedicalSciencesVol.25No.2Apr.2004
E无血清培养基,37℃,50mL・L-1
(5%CO2恒温孵育箱中悬浮培养。
24h后选生长明显的毛囊(≥0.1mm加入NGF或米诺地尔继续培养,无需换液。
1.4 实验分组 我们共培养成功了约100根毛囊,
随机取72根毛囊,分成3组,每组24根。
第一组为空白对照组,单纯毛囊培养组;第二组为阳性对照组,加入米诺地尔125mg・L-1;第三组为NGF组,加入的NGF质量浓度是100μg・L-1。
1.5 毛囊形态观察与长度测量 每组随机18根毛
囊,每天在倒置显微镜下连续观察毛乳头、真皮组织鞘、内皮根鞘、外皮根鞘及毛干的变化。
每天目镜测微器测量毛囊长度。
另外取部分正常培养的毛囊,以冰冻包埋剂(OCT包埋,-21℃下作10μm厚的冰冻切片,HE染色。
1.6 3H2TdR掺入与测定 每组6根毛囊,加入
3
H2TdR使其终浓度为2mCi・L
-1
继续培养24h。
取出毛囊,0.01mol・L-1PBS冲洗3遍,置于闪烁杯中,加入20mL・L-1(2%乙酸200μL,70℃水浴至毛囊全部溶解,加入二氧六环闪烁剂6mL,液闪记数。
测量3遍,取平均值。
1.7 统计学处理 生长长度用单侧t检验。
2 结 果
2.1 离体毛囊形态变化 倒置显微镜下观察毛干与
内外根鞘都有明显的延长,而结缔组织鞘则无明显变
化(图1。
毛囊中毛干、内皮根鞘、外皮根鞘和结缔组织鞘各个层次清晰,毛乳头呈锥形嵌入毛母质中。
毛囊生长末期,毛干与内皮根鞘之间的界限开始模糊不清。
毛球与毛干上移,毛球形态不规则,毛根变成杵状(图2。
冰冻切片结果观察:
冰冻切片HE染色光镜下观察可见毛皮质、毛小皮、内皮根鞘、外皮根鞘及结缔组织鞘等结构。
其中毛皮质呈灰紫色,下部可见黑素颗粒;内根鞘细胞胞浆呈深红色;外根鞘细胞为多层,呈蓝紫色;结缔组织鞘和毛乳头呈淡红色。
生长快的毛囊外根鞘柱状细胞层数较多,胞核颜色较深,毛乳头体积较大(图3,而生长慢的毛囊外根鞘细胞为淡蓝色或淡红色,与内根鞘及结缔组织鞘的颜色相近,部分毛囊下段轻度弯曲(图4
。
图1 毛囊培养5d时,结缔组织鞘无延长,毛干与内外根鞘等率延长
Fig.1Thehairshaftandinternalandexternalrootsheathhadequalelongationwhenthehairfollicleswereculturedonday5 ×40
图2 毛囊培养9d时,毛根变成杵状
Fig.2Thehairrootchangedtopestlshapewhenthehairfollicleswereculturedonday9 ×40
图3 生长快的毛囊外根鞘柱状细胞胞核颜色较深,毛乳头体积较大
Fig.3Thecolumnarcellnucleusofexternalrootsheathinhairfollicleswhichgrewquicklyweredeepstaining,andthepapillaofhairwerecomparativelybig ×40
图4 生长慢的毛囊外根鞘细胞与内根鞘及结缔组织鞘的颜色相近,部分毛囊下段轻度弯曲
Fig.4Thestainingofexternalrootsheath,internalrootsheathanddermalrootsheathweresimilar,andtheinferiorsegmentsofsomehairfolliclewerelightlycurvature ×40
2.2 离体毛囊生长长度 如图5所示,目镜测微器
测量毛囊长度发现:
100μg・L-1
的NGF与125mg・
L
-1
的米诺地尔一样对离体培养的人头皮毛囊的生长有明显的促进作用(P<0.05。
2.3 3H2TdR摄入率 3H2TdR摄入量以毛囊c・min-1(R表示,计算方法为:
R=(每杯实测
c・min
-1
值-本底c・min-1值/每杯毛囊数。
如表1所示,NGF组与米诺地尔组的3H2TdR摄
821 西安交通大学学报(医学版
第25卷
入量明显增加,即24h的DNA合成率明显增高
。
图5 各组前8d生长状况
Fig.5Thegrowthstatusofeverygroupduringthefirst8days
表1 各组24h3H2TdR摄入量
Table1 Theratesofincorporationof3H2TdR(c・min-1
GroupBackground
Negative
controlMinoxidilNGFCPM124137920032442CPM212137219982484CPM336151721012602Averagevalue24.000
1422.6672034.0002509.333R
237.11
339.00
418.22
3 讨 论
在离体培养条件下,我们通过目镜测微器测量毛囊长度发现100μg・L-1的NGF与125mg・L-1的米诺地尔一样对人头皮毛囊有促生长作用。
3
H2TdR摄入实验也说明NGF与米诺地尔组的毛囊24hDNA合成率明显增高。
实验结果说明100μg・L-1的NGF对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用。
最初神经营养因子是作为神经发育调节剂被发现和鉴定的。
现在人们已熟知神经营养因子有着更广泛的功能。
根据同源性大小,基因表达部位和蛋白作用的专一性以及信号传递机制的不同,可将神经营养因子分为三个家族:
神经生长因子家族、睫状神经营养因子家族和胶质细胞源性神经营养因子家族。
神经营养因子和它们的受体在多种细胞中都有表达,包括角朊细胞。
有研究表明NGF刺激角朊细胞增殖并且是角朊细胞的存活因子,可能是通过保持抗凋亡原癌基因产物Bcl22的相对水平来实现的2。
近年来,许多研究已表明神经营养因子(主要是神经生长因子家族和胶质细胞源性神经营养因子家族在毛囊的生长发育中起着关键性的作用。
“一夜愁白头”与周围神经损伤患者相应区域的毛囊萎缩现象提示神经对毛囊的营养作用。
动物实验切除脊髓后根或周围神经后毛发生长受阻,也佐证了上述观点。
小鼠的皮肤有3组水平走向的神经丛:
表皮下神经丛、真皮下神经丛和皮下组织神经丛。
其中真皮下神经分出神经纤维围绕毛囊峡部形成毛囊峡部神经网3。
这又从组织形态上证实神经与毛囊的生长有密切的关系。
毛囊既分泌神经营养因子又是神经营养因子的靶器官。
毛囊的神经营养因子既有来自雪旺细胞和神经旁分泌的,也有来自毛囊本身自分泌的。
在毛囊的形态发生中,NGF、NT3、NT4和BDNF都有表达。
最近就有研究表明NGFmRNA和它的翻译产物在生长期羊毛囊中有表达,位于增生的毛球部及其上方的分化细胞4。
同时,神经营养因子的受体TrkA、TrkB、TrkC和p75NGFR在毛囊形态发生中也有表达。
低亲和力受体p75NGFR,可结合NT3、NT4、BDNF和NGF,位于隆突部周围间质细胞和隆突部的下方。
最近又发现p75NGFR信号途径与退行期角朊细胞凋
亡有关5,p75NGFR剔除鼠的退行期也明显迟缓6。
在研究中又发现,TrkA在毛囊形态发生的各期表皮中都有表达,而p75NGFR则在7,8期毛囊中彻底消失7
。
因而可以推断,NGF控制毛囊形态发生后期可能是通过TrkA信号通路起作用的。
基因研究表明毛囊形态发生中不仅表达NGF和TrkA,而且胚胎鼠过表达NGF在转基因鼠皮肤中可轻度加速毛囊的形态发生。
NGF基因剔除鼠表现出延缓毛发生长;NGF缺乏鼠毛囊生长受限,毛发周期缩短且毛囊过早进入退行期。
而转基因成鼠过表达NGF(在启动子14作用下则表现出加速退行期8。
在有毛皮片器官培养中,NGF可显著增加处在8期的毛囊比例。
鼠皮片器官培养时NGF刺激休止期毛囊的角质形成细胞增殖,而对处于增殖期高峰(生长早期的毛囊角质形成细胞却表现抑制作用9。
这种相反的作用或许与细胞周期或细胞分化有关。
临床现象和实验研究表明神经对毛囊的作用机制可能有两种:
一是通过调控毛囊周围的血管分布对毛囊营养进行调控;另一种就是皮肤神经通过分泌一些因子作用于毛囊,从而调控毛囊的增殖、分化和凋亡8。
我们的实验结果说明100μg・L-1的NGF对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用。
在去除体液、神经等其他影响因素的条件下,证明NGF对离体的人头皮毛囊的促生长作用是直接的。
一方面可能是通过本身的受体通路直接刺激毛母质细胞和外皮根鞘细胞增殖实现的,另一方面可能是促进毛乳头细胞分泌一些促上皮形态发生物质和生长因子,从而间接调节毛囊生长。
具体的机制有待于进一步研究。
(下转第141页
增生,基底膜增厚,管腔狭窄甚至闭塞,神经的缺血缺氧已经达到了相当高的程度;此时,业已下降的NO对血管功能的微弱调节不足以对神经血供造成显著的影响,因而对神经功能损害的加重不起主要作用。
血管因素的其他方面及代谢因素8可能在DPN的发展中占主导地位。
有实验表明,NO供体或合成原料L2arg的补充,可使神经内血流灌注有显著性恢复。
自由基清除剂也可通过减少自由基对NO灭活改善神经内血流及神经传导速度。
多项实验研究的结果证实,内皮源性NO的减少对神经内血流供应有显著影响,说明NO在糖尿病神经病变发生的血管机制中占重要地位。
神经血液供应的减少导致神经缺氧,进而引起神经营养受损、再生障碍。
本研究通过检测22DM患者血清NO水平,对NO与22DM及DPN的关系进行了初步探讨,发现22DM患者血清NO水平的变化是一个随病程变化的过程。
代谢紊乱的早期,血清NO显著升高;随着病程的延长,血清NO逐渐下降;至疾病中晚期,血清NO较正常人群显著降低;这种变化可能涉及到糖尿
病血管病变的发生;22DM患者DPN的发生与血清NO水平密切相关;DPN的发展与血清NO无明显关系。
而DM发生时NO减少引起DPN发生的具体机制尚待进一步研究。
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(编辑 韩维栋
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