安农大 微生物工程 复习.docx
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安农大 微生物工程 复习.docx
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安农大微生物工程复习
第三代微生物发酵技术——微生物工程:
是以微生物为主体,应用生物科学,特别是微生物学的理论和方法,结合现代工程技术手段,利用微生物的某种特定性状和功能,按照人们设计的蓝图,改良、加工、繁殖微生物,以获取微生物体本身或其代谢产物等有用物质,为人类生产、生活为目的的一门新兴学科。
微生物工程的应用:
1.微生物工程在食品工业中的应用:
包括传统的含醇饮料、调味品、乳制品等,至今其产量和产值还占生物技术的首位。
含醇饮料:
葡萄酒、果酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌、伏特加等。
传统调味品及发酵食品:
酱、酱油、醋、豆鼓、豆腐乳、饴糖、泡菜等。
发酵乳制品:
奶酒、干酪、酸奶等;
2.微生物工程在医药卫生中的应用:
抗生素、氨基酸、维生素、甾体激素、生物制品、治疗用酶、酶抑制剂。
半合成抗生素:
某些天然抗生素在去侧链后,可用化学合成法接上新的侧链而改变原有抗菌谱或其它特性,这样的抗生素就被称为半合成抗生素。
常用的半合成抗生素:
青霉素型和头孢菌素型。
常用的半合成青霉素:
甲氧苯青霉素(新青Ⅰ)、乙氧萘青霉素(新青Ⅱ)、苯唑青霉素(新青Ⅲ)、氨苄青霉素、羟氨苄青霉索等。
3.微生物工程在轻工业中的应用:
主要是用于轻工业及其食品工业中的酶:
糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、过氧化氢酶。
4.微生物工程在化工能源产品中的应用:
利用发酵、生物转化或酶法生产下列产品:
烷烃、醇及溶剂、有机酸、多糖、清洁能源。
5.微生物工程在农业中的应用:
生物农药、生物除草剂、生物增产剂、食用菌和药用真菌。
6.微生物工程在环境保护中的应用:
厌气发酵法、好气发酵法。
7.微生物工程在细菌冶金中的应用:
8.微生物工程在高技术研究中的应用:
如基因工程中用的限制性内切酶、连结酶、DNA探针等;生物芯片(blochip)等。
第二代微生物发酵技术——深层培养技术(deepculture)、
沉没培养法、液体培养法。
在深层的液体培养中进行的一种发酵培养方法。
操作时将无菌空气通入容器中,不断搅拌,使微生物充分与氧气接触而迅速繁殖。
占地面积小,劳动力省,产量高,适合于机械化和自动化生产。
适用于需氧性微生物。
微生物工程的工业生产三个要素:
生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中优良的菌种是最重要的。
一般菌种分离纯化和筛选步骤如下:
标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏。
标本的预处理方法:
(1)采用热处理方法减少材料中的细菌数:
放线菌的繁殖体、孢子和菌丝片段。
(2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞。
(3)采用化学方法。
(4)诱饵法:
将固体基质等加到待检的土壤或水中,待其菌落长出后再铺平板分离。
(5)空气搅拌法:
在空气中搅拌,收集孢子沉淀,如稻草的处理。
菌种的分离:
(1)施加选择性压力分离法:
利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物的生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势,而得以快速分离纯化的目的。
分离培养基的效率取决于其养分,pH和加入的选择性抑制剂等。
培养方法:
液体培养方法和固体培养方法。
固体培养方法:
固体培养基常用于分离某些酶产生菌,其选择培养基中常含有所需酶的基质,以便促进酶产生菌的生长。
液体培养方法:
摇瓶培养(分批式富集培养),连续培养(恒化式富集培养)。
(2)随机分离方法:
抗生素产生菌的分离、抗肿瘤药物产生菌的分离、酶抑制剂产生菌的分离、生长因子产生菌的分离、多糖产生菌的分离。
菌种选育方法:
自然选育+人工选育:
诱变、杂交、原生质体融合、基因工程。
自然选育的优点:
简单易行,并可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。
缺点:
效率低、进展慢。
诱变育种的基本过程:
选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→筛选→保藏和扩大试验。
出发菌株应具备:
(1)对诱变剂的敏感性高;
(2)具有特定生产性状的能力或潜力。
出发菌株的来源:
(1)自然界直接分离到的野生型菌株;
(2)历经生产考验的菌株;
(3)已经历多次育种处理的菌株。
制备细胞悬液:
要求:
(1)菌体处于对数生长期,并使细胞处于同步生长;
(2)细胞分散且为单细胞,以避免表型迟延现象(phenotypiclag);
诱变剂的作用:
(1)提高突变的频率;
(2)扩大产量变异的幅度;(3)使产量变异朝着正突变或负突变移动。
杂交育种指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合,使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有新性状的菌株。
1.细菌杂交:
细菌的杂交可以通过细菌接合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等发生基因重组。
普遍性转导,双交换形成转导子。
2.放线菌的杂交育种:
(1)放线菌的杂交原理:
包括四种遗传体系:
a.异核现象:
所谓异核体即同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核。
b.接合现象:
菌丝间接触和融合后,相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖过程中,发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。
接合现象的结果导致部分合子的形成。
部分合子是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的,但亦可能两个亲本染色体都不完整。
c.异核系的形成:
当部分合子形成后,接着就产生杂合的无性繁殖系(异核系Heterroclone)的细胞核,即经过一次单交换而产生的异核系染色体组。
它有一个二体区,根据交换数目和染色体间的关系而产生单倍重组体或重组异核系。
异核系的菌落形态很小,遗传类型各不相同。
能在基本培养基上或选择性培养基上生长。
但将异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。
d.重组体的形成:
异核系不稳定,在菌落生长过程中,染色体重叠两节段(二体区)的不同位置上发生交换后,能产生重组体孢子。
异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体,而成为一个单倍的无性繁殖系,能长出各种类型的分离子。
(2)放线菌的杂交方法:
常用的放线菌杂交方法主要有三种,即混合培养法、平板杂交法、玻璃纸转移法。
具体步骤为:
(1)玻璃纸混合培养;
(2)混合培养物的转移;(3)异核系的分离。
3.霉菌的杂交育种:
(1)准性生殖的过程:
是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。
准性生殖的整个过程包括三个相互联系的阶段,即异核体的形成,二倍体的形成,体细胞重组。
(2)霉菌的杂交技术:
选择直接亲本:
具有遗传标记。
异核体的形成:
混菌培养。
双倍体的检出:
斑点和扇面。
分离子的检出:
纯化、鉴别。
原生质体融合的优越性:
(1)有利于不同种属微生物的杂交。
(2)重组频率高于其他杂交方法。
(3)遗传物质传递更加充分、完善,既有核配,又有质配。
(4)可以用温度、药物、紫外线等处理、纯化亲株的一方或双方,然后使之融合再在再生菌落中筛选重组子,提高筛选效率。
(5)用微生物的原生质体进行诱变,可明显提高诱变频率。
原生质体融合方法:
(1)原生质体制备:
方法:
主要是酶法,如溶菌酶、纤维素酶等。
原生质体制备后,由于原生质体对渗透压敏感,所以必须使它处于高渗环境中以维持其稳定性,否则就会在低渗条件下破裂失活。
(2)原生质体融合:
原生质体的融合有自然融合与人工融合之分;前者虽然发生融合,但其融合率极低。
因此,往往以化学融合剂或电场诱导法进行人工融合,以提高其融合率。
目前最为常用的方法是将二亲本菌株的原生质体混合在一起,以PEG助融。
(3)原生质体再生:
再生即是使原生质体再生成细胞,这样才可以对它的子代进行遗传鉴别。
(4)融合子的检出:
原生质体融合后,是否形成融合重组菌株,一般可用下列方法进行检测:
直接法:
将融合液涂布在不补充两亲株生长所需的营养物质,或者补充有二种药物的再生平板上,直接筛选出原养型的成双重抗药性的重组菌株;或者利用荧光染色法,直接在荧光显微镜下观察挑取。
间接法:
即将融合液涂布在丰富营养的再生平板上,使未融合的亲本菌株和已融合的重组菌株都能再生,然后用影印接种法,接种在选择培养基上以检出重组菌株,进一步选出高产菌株。
质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。
质粒的分裂不稳定:
是指基因工程菌分裂时,出现一定比例不含质粒的子代菌。
质粒的结构不稳定:
是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失,引起基因工程菌性能的改变。
质粒不稳定产生的原因:
一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率;二是这两种菌的比生长速率(μ)差异的大小。
提高质粒稳定性的方法:
(1)两阶段培养法;
(2)控制适当的培养条件。
菌种经过长期人工培养或保藏,由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。
菌种衰退的原因是有关基因的负突变。
所谓负突变是指生产菌株的生产性状下降的突变,主要表现为:
在形态上:
分生孢子减少或颜色改变。
在生理上:
常指产量的下降.
防止菌种衰退的方法有:
(1)控制传代次数;
(2)选择合适的培养条件;
(3)利用不同类型的细胞进行传代;
(4)选择合适的保藏方法。
菌种保藏的原理和方法:
菌种保藏主要是根据微生物的生理、生化特性,在人工创造的条件下使其代谢处于不活泼的休眠状态,生长繁殖受到抑制。
这样就能尽可能地减低菌种的变异率。
那么,要创造适于微生物休眠的环境,主要是通过降低培养基营养成分(寡营养)、低温、干燥和缺氧四个手段。
(1)斜面低温保藏法:
将菌种接种在不同成分的斜面培养基上,待菌种充分生长后,便可放在4℃左右的冰箱中进行保藏。
细菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这种保藏方法。
保存期为3-6个月。
原理:
低温下,微生物代谢强度明显下降。
这种保藏方法的弊端:
短期内多次传代;容易引起菌种发生变异,杂菌污染的机会随之增多。
(2)砂土管保藏法:
适合于产孢子或芽胞的微生物。
一般保存期为2年左右,有的可达十至几十年。
原理:
干燥,寡营养。
(3)真空冷冻干燥保藏法:
加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。
适用于各种微生物,便于大量保藏,菌种存活时间长,是目前最好的保藏方法。
原理:
干燥,低温。
(4)液氮保藏法:
将菌种置于保护剂中,预冻后保存在液氮超低温冰箱中(-196℃)。
适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想,可用液氮保藏法。
其保存期最长。
原理:
低温。
用液氮能长期保存菌种。
这是因为液氮的温度可达-196℃,远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃),所以此时菌种的代谢活动已停止,化学作用亦随之消失。
(5)悬液保藏法(寡营养保藏):
将微生物悬浮在不含养分的溶液中,如水、缓冲液、生理盐水,室温保藏,一般为一年。
适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。
原理:
寡营养。
(6)低温保藏法:
-20℃,-40℃,-80℃低温冰箱保藏。
(7)石蜡油封存法:
向培养成熟的菌种斜面上,倒入一层灭过菌的石蜡油,用量要高出斜面一厘米,然后保存在冰箱中。
此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。
保存期约一年左右。
原理:
低温、缺氧。
(8)自然基质保藏法。
菌种的复壮是指创造一个适合原菌株生长繁殖的条件,经分离纯化,淘汰退化型个体或挑出原种型个体的选育菌种的方法。
菌种的复壮措施:
(1)纯种分离:
(平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等);
(2)通过寄主体内生长进行复壮;
(3)淘汰已衰退的个体。
微生物的代谢类型:
分解代谢和合成代谢。
代谢调节是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用,即自我调节。
微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制,以期按照人们的愿望,生产有用的微生物制品。
代谢(自我)调节方式:
细胞透性的调节、代谢途径区域化、代谢流向的调控、代谢速度的调控。
调节部位:
细胞质:
糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成、脂肪酸合成;线粒体:
丙酮酸氧化、三羧酸循环、B-氧化、呼吸链电子传递、氧化磷酸化;细胞核:
核酸合成;内质网:
蛋白质合成、磷脂合成。
酶活性的调节:
酶活性调节是指一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。
影响因素:
底物和产物的性质和浓度、环境因子、其他的酶的存在。
酶活性调节方式:
酶的激活作用和酶的抑制作用。
激活:
在激活剂的作用下,使原来无活性的酶变成有活性,或使原来活性低的酶提高了活性的现象。
代谢调节的激活作用:
主要是指代谢物对酶的激活。
前体激活指代谢途径中后面的酶促反应,可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。
代谢中间产物的反馈激活,指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。
抑制:
由于某些物质的存在,降低酶活性的现象。
反馈抑制:
是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。
抑制可以是不可逆的,这将造成代谢作用的停止;抑制也有可逆的,当抑制剂除去后,酶活性又恢复。
在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的,而且大多属于反馈抑制。
分支代谢的反馈调节方式有多种:
顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、超相加反馈抑制、酶活性的调节。
酶活性调节的机制:
有变构调节理论、化学修饰作用、缔合与解离、竞争性抑制等。
酶合成调节(酶量调节)的类型:
包括诱导和阻遏两种类型。
诱导:
是指在某种化合物作用下,导致某种酶合成或合成速率提高的现象。
阻遏:
是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。
酶合成的诱导与阻遏同时存在于微生物中,通过它们的协调作用能有效地控制胞内酶量变化。
1.酶合成的诱导作用:
在微生物里,酶可以分成诱导酶与组成酶两大类。
组成酶:
是机体内一类不依赖于酶的底物或底物结构类似物的存在而合成的酶,如EMP途径的一些酶。
诱导酶(又称适应酶):
是一类依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。
如:
乳糖酶。
决定诱导酶合成的基因以隐性状态存在于染色体中。
诱导剂:
能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。
诱导剂可以是被诱导的酶的底物或底物的结构类似物。
阻遏酶合成的物质称为阻遏物。
2.酶合成的阻遏:
终点产物(末端产物)反馈阻遏:
如果阻遏物是被阻遏生成的酶(或酶系)所催化生成的终点产物,则这种阻遏现象称为终点产物(末端产物)反馈阻遏。
这种阻遏现象主要发生在合成代谢途径上。
这种现象最初是在大肠杆菌合成甲硫氨酸的途径中被发现的。
如果在培养基中加入过量的甲硫氨酸时,则这些酶系的合成都同时被阻遏。
代谢产物反馈阻遏:
如果阻遏物是其分解代谢的产物,则称为分解代谢产物阻遏。
枯草杆菌二峰生长机理:
由于利用葡萄糖的酶系是固有的,而利用乳糖(或阿拉伯糖、半乳糖等)的酶系是诱导生成的。
在有葡萄糖的情况下,阻遏了利用乳糖的酶系的合成。
因而只有当葡萄糖被利用完之后,乳糖才能诱导能利用它的酶系合成,由于合成新酶系需要一定的时间,所以在二次生长之间出现了一段停滞期。
酶活性调节与酶量调节区别:
1.从调节方式上是不同的。
酶活性调节:
是对现有的酶在活性变化上进行调节,它不会涉及酶量的变化,
酶量的调节:
不涉及现有酶活性的变化,只是通过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化,达到控制代谢过程的目的。
2.从调节作用的特点上看:
酶活性调节的效果既及时又迅速,但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成,它调节的效果较慢。
初级代谢与次级代谢
初级代谢:
是为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子的各种相互关联的代谢网络,对菌的生长是必需的。
产物有单糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白质、核酸、多糖、脂类等等。
次级代谢:
次级代谢主要涉及合成过程,其终产物、次级代谢物对菌的生长不是必需的,对其生命活动可能具有某种意义,通常是在生长后期开始形成的。
次级代谢产物主要有抗生素、维生素、生物碱、色素、毒素等等。
次级代谢的调节方式:
(1)初级代谢对次级代谢的调节;
(2)碳代谢物的调节作用;
(3)氮代谢物的调节作用;
(4)磷酸盐的调节作用;
(5)次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用;
(6)次级代谢中细胞膜透性调节;
工业发酵的目的:
大量积累人们所需要的微生物代谢产物。
代谢的人工控制:
人为地打破微生物的代谢控制体系,使代谢朝着人们希望的方向进行。
人工控制代谢的手段:
控制发酵条件(生物化学方法);改变微生物遗传特性(遗传学方法);改变细胞膜透性。
发酵条件的控制:
1.各种发酵条件对微生物代谢的影响;
2.使用诱导物;
3.添加生物合成的前体。
前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物,能被微生物直接结合到产物分子中去,而自身的结构无多大变化,且具有促进产物合成的作用。
如青霉素G的生产中,苯乙酰-CoA是限速性因子,补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。
前体与诱导物的区别:
有时难于区分促进作用是诱导物的作用还是前体的作用。
一般,可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物,而前体往往只在生产期内起作用。
另外,诱导物可以被非前体的结构类似物取代。
培养基成分和浓度的控制:
在考虑培养基组成与各组成成分的比例时,要保证能够满足机体生长的需要,要有利于代谢产物的形成,同时还要尽量避免使用容易引起分解代谢产物阻遏的成分或避免使用高用量的物质。
在发酵培养基中通常是采用有适量速效碳源或氮源,以促进机体的生长;又要有充足的迟效碳源或氮源,以利于发酵产物的形成,从而也可以避免速效碳源或氮源在机体内产生分解代谢产物阻遏。
例如用甘油代替果糖作碳源培养嗜热脂肪酵母,可以使淀粉酶产量提高25倍以上。
代谢工程:
代谢工程是指利用基因工程技术,定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造,以改变微生物的代谢特性,并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合,构建新的代谢途径,生产新的代谢产物的工程技术领域。
代谢工程三种方式:
改变代谢途径、扩展代谢途径、构建新的代谢途径。
改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向,阻断其他代谢产物的合成,以达到提高目标产物的目的。
改变代谢途径有各种方法,如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。
培养基按其他特殊用途划分:
1.孢子培养基;2.种子培养基;3.发酵培养基(配置要求)。
1.孢子培养基:
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基,对这种培养基的要求是:
能使菌体迅速生长,产生较多优质的孢子,并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。
所以对孢子培养基的基本配制要求是:
(1)营养不要太丰富(特别是有机氮源),否则不易产孢子。
(2)所用无机盐的浓度要适量,不然也会影响孢子量和孢子颜色。
(3)要注意孢子培养基的pH和湿度。
常用培养基有:
麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、食盐等配制成的琼脂斜面培养基。
2.种子培养基:
种子培养基是供孢子发芽、生长和菌体繁殖的。
所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全,氮源和维生素的含量也要高些,提供速效碳源。
3.发酵培养基:
发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长,达到一定的菌丝浓度,又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。
因此,发酵培养基的组成除了有菌体生长所必需的元素和化合物外,还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
发酵培养基的要求:
(1)培养基能够满足产物最经济的合成。
(2)发酵后所形成的副产物尽可能的少。
(3)培养基的原料应因地制宜,价格低廉;且性能稳定,资源丰富,便于采购运输,适合大规模储藏,能保证生产上的供应。
(4)所选用的培养基应能满足总体工艺的要求。
二、发酵培养基的成分及来源:
一、碳源:
1.作用:
提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分。
2.来源:
糖类、油脂、有机酸、正烷烃。
工业:
(1)糖蜜;
(2)淀粉、糊精。
二、氮源:
氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸,蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。
常用的氮源可分为两大类:
有机氮源和无机氮源。
1.无机氮源
种类:
氨盐、硝酸盐和氨水。
特点:
微生物对它们的吸收快,所以也称之谓迅速利用的氮源。
2.有机氮源
来源:
工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料,花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米。
有机氮源和无机氮源应当混合使用。
早期:
容易利用易同化的氮源—无机氮源
中期:
菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
前体
青霉素:
分子量356,苯乙酸:
分子量136。
实际使用时的转化率在46-90%之间。
用法:
采用流加的方法。
前体一般都有毒性,浓度过大对菌体的生长不利前体相对价格较高,添加过多,容易引起挥发和氧化,流加也有利于提高前体的转化率。
产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物,又非前体,但加入后却能提高产量的添加剂。
三、发酵培养基的设计和优化:
一、培养基成分选择的原则:
菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、合适的C、N比、pH的要求。
培养基中碳氮比的影响极为明显。
氮源过多,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少,从而影响产量,碳源过多,则容易形成较低的pH,若碳源不足,易引起菌体衰老和自溶。
一般工业发酵培养基的C:
N为100:
0.2~2.0,谷氨酸产生菌的C:
N为100:
15~21。
(二)实验设计:
培养基成分的含量最终都是通过实验获得的。
合理的实验方法:
多因子实验:
均匀设计、正交实验设计、响应面分析等;单因子实验。
培养基设计的步骤:
(1)根据前人的经验和培养基成分确定一些必须考虑的问题,初步确定可能的培养基成分;
(2)通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分;
(3)当培养基成分确定后,剩下的问题就是各成分最适的浓度,由于培养基成分很多,为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法如正交实验设计、响应面分析法。
补料的作用:
(1)丰富培养基,避免了菌体过早衰老,使产物合成的旺盛期延长;
(2)控制了pH值和代谢方向;(3)改善了通气效果,避免了菌体生长可能受到的抑制;(4)补料还能补足发酵液的体积。
种子扩大培养是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
目的:
使发酵周期缩短,设备利用率提高。
作为种子的准则是:
(1)菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,延滞期短.
(2)生理性状稳定。
(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。
(4)无杂菌污染。
(5)保持稳定的生产能力。
种子罐的作用在于使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体,接入发酵罐培养基后能迅速生长,达到一定菌体量,以利于产物的合成。
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数,这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度,以及所采用发酵罐的容积而定。
种子级数越少越好,可简化工艺和控制,减少染菌机会。
种子级数太少,接种量小,发酵时间延长,降低发酵罐的生产率,增加染菌机会。
(2)接种龄与接种量
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。
通常接种量,细菌1~5%,酵母菌5~10%,霉菌7~15%,有时20~25%。
接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期,且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。
影响孢子质量的因素及控制:
培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间、接种量、接种龄。
种子质量的控制措施:
种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。
因此首先必须保证生产菌种的稳定性,其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵
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