考点加强课5 基因表达载体构建中限制酶的选择原则.docx

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考点加强课5基因表达载体构建中限制酶的选择原则

限制酶选择的三大依据

1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

图1

（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ（目的基因两端均具PstⅠ）。

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类

（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

（3）所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点（如图2中KpnⅠ）。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

（4）所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶

若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

（分析如下）

1.（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接，理由是___________________________________________。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　，不能表达的原因是______________________。

图（c）

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有　　　　和　　　　，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________________。

[慧眼识图　获取信息]

（1）三种限制酶切割结果分析

（2）基因表达载体分析

答案　

（1）Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　

（2）甲、丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录

（3）E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶

2.（2016·经典高考）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。

请回答下列问题：

（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用　　　　两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过　　　　酶作用后获得重组质粒。

为了扩增重组质粒，需将其转入处于　　　　态的大肠杆菌。

（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加　　　　，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中　　　　。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为　　　　，对于该部位，这两种酶　　　　（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。

（4）若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得　　　　种大小不同的DNA片段。

审题指导

第一步：

首先看目的基因两侧有何种切割位点以保障能将目的基因“切出”

如图2使用BamHⅠ、BclⅠ可切断左侧，HindⅢ、Sau3AⅠ可切断右侧

第二步：

再回到“质粒”，看质粒中限制酶切割位点，如图中总共有BamHⅠ、BclⅠ、BamHⅠ及HindⅢ四个限制酶识别位点，其中并不存在目的基因中Sau3AⅠ酶识别位点，故不选Sau3AⅠ酶，而BamHⅠ在四环素抗性基因与氨苄青霉素抗性基因中均存在，倘若使用该酶将会导致两个标记基因同时被破坏，故只能选择BclⅠ与HindⅢ，而使用此两类酶将导致氨苄青霉素抗性基因遭破坏，因此制备重组质粒选择培养基时只能依据“四环素抗性基因”，如下图所示：

此外，根据BamHⅠ和BclⅠ的酶切位点，BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为

，这与两种酶的酶切位点均不同，即两种酶在该片段找不到识别位点。

又根据BamHⅠ、BclⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。

答案　

（1）BclⅠ和HindⅢ　DNA连接　感受　

（2）四环素　引物甲和引物丙　（3）

　都不能　（4）7

1.（2019·河南中原名校联考）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。

乙型肝炎疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。

血源性“乙型肝炎疫苗”是取用乙肝病毒感染者的血液，用差速离心提纯血液中的乙肝病毒，之后再灭活，制成乙肝疫苗。

基因工程乙肝疫苗的生产和使用过程如图1，图2示意大肠杆菌质粒的相关基因与限制酶切点；图3示意有关限制酶在DNA分子中的具体切点。

请回答相关问题：

（1）从图1可知，该目的基因的具体功能是_______________________________。

（2）选择大肠杆菌质粒作为运载体的原因是__________________。

（3）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因：

__________________________________________。

（4）形成有效的重组质粒，选择适当的限制性内切酶很重要。

某学习小组根据图2和图3提出了三种方案：

单独使用BamHⅠ、分别使用BamHⅠ和EcoRⅠ以及分别使用HindⅢ和EcoRⅠ，且认为选择使用BamHⅠ和EcoRⅠ最佳。

该方案的优点是_____________________________。

如果选择使用HindⅢ和EcoRⅠ，则在构建重组质粒后，还需要运用　　　　技术以检测目的基因是否导入受体细胞。

答案　

（1）指导合成乙肝病毒外壳

（2）①对受体细胞无害；②具标记基因，能对重组DNA是否进入受体细胞进行鉴定；③在宿主细胞内能自我复制；④具有多个酶切位点，供外源基因插入其中。

（3）血源性疫苗需灭活破坏其核酸结构，灭活不成功则会导致接种者患乙肝，而基因工程疫苗仅有乙肝病毒外壳，不需要灭活

（4）既防止了质粒发生自身环化和目的基因与质粒之间的反向连接，又便于筛选出含有目的基因（重组质粒）的受体细胞　DNA分子杂交（或核酸分子杂交、分子杂交）

2.（2019·山东湖北部分重点中学联考）如图所示为培育二倍体转基因抗虫玉米的两种思路。

EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ为限制酶（箭头所指为酶切位点）。

回答下列问题：

（1）据图，获取目的基因时不能选择SmaⅠ酶的原因是它__________________

______________________________________________________。

选择EcoRⅠ和BamHⅠ酶的优点是可避免目的基因与质粒　　　　连接。

（2）与思路1相比，思路2的最大优点是获得的转基因抗虫玉米　　　　。

（3）培育转基因抗虫玉米的核心步骤是__________________________________。

其目的是使目的基因在受体细胞中__________________________________。

（4）将重组质粒导入受精卵，采用最多的方法是农杆菌转化法，这跟农杆菌的　　　　有关。

（5）操作⑤常用的方法是_______________________________。

解析　

（1）题图显示：

目的基因中存在SmaⅠ的识别位点。

若使用SmaⅠ切割外源DNA，则会破坏外源DNA中的目的基因的结构，因此获取目的基因时不能选择SmaⅠ切割。

EcoRⅠ和BamHⅠ的识别位点不同，形成的黏性末端不同，因此选择EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA，其优点是可避免目的基因与质粒反向连接。

（2）思路1是将重组质粒导入玉米的受精卵中，由该受精卵发育成的植株不一定都是纯合子，思路2是将重组质粒导入由花粉经过脱分化形成的愈伤组织中，由该愈伤组织形成的单倍体幼苗2再经过人工诱导，使其染色体加倍，最终得到的玉米株都是纯合子。

可见，与思路1相比，思路2的最大优点是获得的转基因抗虫玉米都是纯合子（或答不发生性状分离）。

（3）培育转基因抗虫玉米采用的是基因工程技术，该技术的核心步骤是基因表达载体的构建。

构建基因表达载体的目的是：

使目的基因在受体细胞中稳定存在并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

（4）农杆菌的Ti质粒上具有T－DNA，T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上。

在培育转基因植物时，采用最多的方法是农杆菌转化法，正是利用了农杆菌的Ti质粒上具有的T—DNA的这一特点。

操作⑤是人工诱导染色体数目加倍，常用的方法是用秋水仙素处理幼苗。

答案　

（1）破坏目的基因的结构　反向　

（2）都是纯合子（或答不发生性状分离）　（3）基因表达载体的构建　稳定存在并可遗传给下一代同时使目的基因能够表达　（4）Ti质粒上具有T－DNA

（5）用秋水仙素处理幼苗

课后·加强训练

（时间：

15分钟）

1.（2019·河南名校联盟调研）如图所示为培育转基因细菌的操作流程，回答下列问题：

（1）图中①过程所用工具酶有　　　　　　　　。

为了防止载体和外源DNA自连，应如何操作？

____________________________________。

（2）当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时，该转化过程又称转染。

图中外源DNA来自　　　　。

为了提高转染效率，应使用　　　　处理细菌。

（3）图中②过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？

____________________。

（4）图中③过程，筛选含重组质粒的细菌需用到　　　　基因的功能。

已知所用载体内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养基上生长，但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源DNA细菌的前提条件：

_________________________________________（答出两点即可）。

解析　根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自（DNA）病毒。

另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。

答案　

（1）限制酶和DNA连接酶　应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA

（2）（DNA）病毒　Ca2＋

（3）模板、原料、酶和能量等

（4）标记　原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素抗性基因内部

2.（2018·山东聊城一模）屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法而获得诺贝尔奖。

寄生于人体细胞内的疟原虫是疟疾的病原体。

科学家通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产高效植株，进行基因测序发现该植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）如果用高产青蒿关键酶基因的mRNA反转录产生的cDNA片段与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群叫做青蒿的　　　　；获得的cDNA与青蒿细胞中该基因碱基序列　　　　（填“相同”或“不同”）。

在提取RNA时需要向提取液中添加RNA酶抑制剂，其目的是___________________________

______________________________________________________。

（2）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。

请回答：

用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时不能使用SmaⅠ切割，原因是　　　　　　　　　　。

构建重组质粒时在其目的基因前需要添加特定的启动子，启动子的作用是　　　　　　。

（3）基因表达载体导入组织细胞后，要通过植物组织培养技术培育出青蒿幼苗，该技术的关键步骤是　　　　。

鉴定该基因工程是否成功还要进行　　　　实验，但是不能直接在培养基上培养疟原虫观察，其原因是_____________________

______________________________________________________________。

答案　

（1）cDNA文库（或部分基因文库）　不同　防止RNA的降解

（2）SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因及外源DNA的目的基因　RNA聚合酶识别和结合位点

（3）脱分化和再分化　接种　疟原虫营寄生生活

3.（2019·淄博模拟）研究发现，人体内的N基因是正常基因，无N基因的人会患严重肾病而早年夭折，科学家为治愈此病进行了相关探索。

下图是对标记基因（绿色荧光蛋白基因，用GFP基因表示）和N基因的酶切过程。

请据图分析回答下列问题：

（1）切割基因时选用不同限制酶的目的是　　　　。

切割完成后，需用DNA连接酶将两基因连接成GFP—N融合基因（以下称融合基因），该融合基因的上游基因为_____________________________________________。

（2）若用质粒作运载体，需用图中的　　　　酶切割质粒。

在构建的融合基因表达载体中，调控融合基因转录的结构为　　　　。

（3）将融合基因表达载体包埋在由磷脂双分子层构成的脂质体内并转染ES细胞，融合基因表达载体进入ES细胞的方式为　　　　　　　　。

用激光激发ES细胞并用荧光显微镜观察，可确定细胞内有　　　　现象的ES细胞转染了融合基因。

（4）ES细胞在功能上具有　　　　。

将整合了融合基因的ES细胞，在培养液中培养并加入相应的分化诱导因子后，ES细胞进行　　　　，最终形成正常的肾小球足突细胞，可用于该肾病的治疗。

答案　

（1）防止基因自身环化和不正确的连接　N基因

（2）KanⅠ、XbaⅠ　启动子和终止子

（3）胞吞　绿色荧光

（4）发育的全能性　分裂、分化

4.（2019·黄石模拟）科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长，质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制性核酸内切酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为氨苄青霉素抗性基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。

请据图作答：

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或多种限制性酸进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶　　　　分别对　　　　进行切割，切割后产生的DNA片段分别为　　　　、　　　　种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有　　　　作为标记基因。

（3）研究人员通常采用　　　　法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。

通常采用　　　　技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。

图中③④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的　　　　过程。

答案　

（1）PstⅠ、SmaⅠ　含鱼抗冻蛋白基因的DNA　质粒　4　2

（2）氨苄青霉素抗性基因（ampr）　（3）农杆菌转化（或基因枪法等，答案合理即可）　抗原—抗体杂交　（4）脱分化、再分化