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食品微生物检测实验备课讲稿
食品微生物检测实验
实验一食品中细菌总数的检验
一、实验目的要求
1、了解细菌总数检验的意义。
2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法
3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能
4、熟练无菌操作技术。
二、原理
菌落总数是指食品经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。
三、试剂和仪器
(一)最先准备的器材(清洗、烘干、包扎、灭菌)
规格名称数量用途
1、500ml广口瓶1个稀释样品
2、500ml三角瓶1个配制生理盐水
3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂
4、18×180mm试管3支稀释样品
5、1ml移液管5支
6、直径为90mm平皿10套倒营养平板
7、250ml量筒1支
8、玻璃珠:
直径约5mm
(二)应灭菌、消毒的器材
剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸:
适量
酒精消毒的器材:
吸耳球1个,滴管胶头4只,开瓶器
(三)应制备的培养基
培养基总量所用容器
1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶
2、平板计数琼脂(PCA)培养基:
2瓶100ml/瓶250ml三角瓶
四、实验内容
(一)、基本操作过程:
样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。
(二)、样品的稀释(样品的处理)
样品:
袋装乳粉
外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口,用无菌剪刀开封取样。
称取检样25g,放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中,然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入(先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状,再全部加入,以免奶粉结团),采用振摇法(用力快速振摇50次,振幅不小于40cm)振摇均匀,即为1:
10的稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:
10的均匀稀释液。
2、用1ml灭菌吸管,吸取1∶10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内,振摇试管混合均匀,制成1∶100稀释液。
3、另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用另一支1ml灭菌吸管。
4、根据对检样污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内,每个稀释度做2个平皿。
5、用1ml生理盐水作空白对照试验,做2个平皿。
◆注意:
①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部,也不得触及管内稀释液。
②吸管插入检样液内取样稀释时,插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。
③进行稀释时,应使吸管内的液体沿管壁小心流加入,以免增加检液。
④每递增稀释一次,即换用一支1ml灭菌吸管。
(三)、倒平板
稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基(放置于46℃水浴保温)倾注入平皿约15ml,并转动平皿使混合均匀。
◆注意:
①培养基不能触及平皿口边沿,加入培养基后可正反两个方向旋转,但不可用力过度,以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿,所用时间不宜超过20min。
(四)、培养
待琼胶凝固后,翻转平皿,置36±1℃温箱内培养48h后取出,立即计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。
◆注意:
(1)琼脂凝固后,就立即将平板放入培养箱内进行培养,以免细菌蔓延生长。
(2)如果把不能立即计数,要将平板放入0~4℃冰箱中,但不能超过24h。
●不同产品菌落总数测定的培养时间:
肉、乳、蛋及制品:
37℃培养48h
水产品:
30℃培养48h:
清凉饮料、调味品、糕点、果脯、酒类等:
37℃培养24h
五、结果报告
1、平皿菌落数的选择
(1)选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。
每一个稀释度应采用两个平皿,大于300的可记为多不可计。
(2)其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,则可以计算半个平板后乘以2,以代表一个平板的菌落数。
(3)当平板上有链状菌落生长时,如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限,则应作为一个菌落计,如存在有几条不同来源的链,则每条链均应按一个菌落计算,不要把链上生长的每一个菌落分开计数。
2、菌落总数的计算
(1)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)中菌落总数结果。
(2)若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按如下公式计算:
N=∑C/(n1+0.1n2)d…………
(1)
式中:
N―样品中菌落数;
∑C―平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
nl―第一个适宜稀释度平板数;
n2―第二个适宜稀释度平板数;
d―稀释因子(第一稀释度)。
(3)若所有稀释度的平板菌落数均>300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
(4)若所有稀释度平板菌落数均<30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。
(5)若所有稀释度平板均无菌落生长,则应按<1乘以最低稀释倍数计算。
(6)若所有稀释度均不在30~300之间,有的>300,有的又<30,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3、报告方法
(1)菌落数在1~100时,按四舍五入报告两位有效数字。
(2)菌落数≥100时,第三位数字按四舍五入计算,取前面两位有效数字,为了缩短数字后面的零数,也可以10的指数表示。
(3)若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
(4)若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
(5)称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
计数下表中的数值:
稀释度及菌落数
菌落总数/
[cfu/g(mL)]
报告方式/
[cfu/g(mL)]
10-1
10-2
10-3
实验二食品中霉菌和酵母菌的检验
一、实验目的要求
1、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能
2、熟练无菌操作技术。
二、原理
酵母菌是真菌中的一大类,通常是单细胞,呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌,能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
霉菌和酵母也可造成中腐败变质。
由于它们生长缓慢和竞争能力不强,故常常在不适于细菌生长的食品中出现,这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品,含有抗菌素的食品等。
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻,以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术,它们能转换某些不利于细菌的物质,而促进致病细菌的生长;有些霉菌能够合成有毒代谢产物-霉菌毒素。
霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。
例如,酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖,可使食品发生难闻的异味,它还可以使液体发生混浊,产生气泡,形成薄膜,改变颜色及散发不正常的气味等。
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌,并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。
目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。
我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
三、试剂和仪器
(一)最先准备的器材(清洗、烘干、包扎、灭菌)
规格名称数量用途
1、500ml广口瓶1个稀释样品
2、500ml三角瓶1个配制生理盐水
3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂
4、18×180mm试管3支稀释样品
5、1ml移液管5支
6、10ml移液管1支
6、直径为90mm平皿10套倒平板
7、250ml量筒1支
8、玻璃珠:
直径约5mm适量
(二)应灭菌消毒的器材
剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸:
适量
酒精消毒的器材:
吸耳球1个,滴管胶头4只
(三)应制备的培养基
培养基总量所用容器
1.灭菌蒸馏水:
1瓶300ml/瓶500ml三角瓶
2.马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA):
2瓶120ml/瓶250ml三角瓶
四、实验内容
(一)、基本操作过程:
样品称量→→样品的稀释→→倾注平皿→→培养5天→→计数报告。
(二)、样品的稀释(样品的处理)
样品:
糖果
用灭菌镊子夹取包装纸,称取数块共25g,加入预温至45℃的灭菌水225mL,待溶化后检验。
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口,以无菌操作开封取样。
称取检样25g,放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中。
然后加入225mL的灭菌水,采用振摇法(用力快速振摇50次,振幅不小于40cm)振摇30min,振摇均匀,即为1:
10的稀释液。
2、用10ml灭菌吸管,吸取1∶10稀释液10ml,注入无菌试管内,另用带橡皮乳头的1ml灭菌吸管反复吹吸50次,使霉菌孢子充分散开。
3、用1ml灭菌吸管,吸取上述1∶10稀释液1ml,注入含有9ml灭菌水的试管内,换一支1ml灭菌吸管反复吹吸5次,制成1∶100稀释液。
4、另取1ml灭菌吸管,吸取上述1∶100稀释液1ml,注入含有9ml灭水的试管内,按上项操作顺序作10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次,即换用另一支1ml灭菌吸管。
5、根据对检样污染的情况估计,选择3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度做2个平皿。
6、用1ml无菌水作空白对照试验,做2个平皿。
◆注意:
①加入检样液时,吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部,也不得触及管内稀释液,并将吸管内的液体沿管壁小心流加入,以免增加检液。
②吸管插入检样液内取样稀释时,插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内紧贴。
③每递增稀释一次,即换用另一支1ml灭菌吸管。
(三)、倒平板
稀释液移入平皿后,及时将凉至46℃的培养基(可放置于46℃水浴保温)倾注入平皿约15ml,并正反转动平皿使混合均匀。
◆注意:
①培养基不能触及平皿口边沿,加入培养基后可正反两个方向旋转,但不可用力过度,以免溅起触及上盖。
②检样从开始稀释到倾注最后一个平皿,所用时间不宜过长。
(四)、培养:
待琼脂凝固后,翻转平皿,置25~28℃温箱内培养5天,从第3天开始观察后取出,共观察培养5天。
五、菌落计数及报告:
选取菌落数在10CFU~150CFU的平板,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。
霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。
菌落数应采用两个平板的平均数。
1)计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数计算。
2)若所有平板上菌落数均大于150CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
3)若所有平板上菌落数均小于10CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4)若所有稀释度平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算;如为原液,则以小于1计数。
样品
10-1
10-2
10-3
五、结果报告
样品
稀释度及菌落数
菌落总数/
[cfu/g(mL)]
报告方式/
[cfu/g(mL)]
10-1
10-2
10-3
鲜豆腐
豆腐干
豆奶
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