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研究报告
曲阜师范大学
2010年本科生科研训练研究报告
名称:
壳聚糖酶高产菌株的选育及培养条件的优化
成员:
王文爽(08生物科学)
董冬(08生物科学)
窦春萌(08生物科学)
秦姗姗(08生物科学)
杨永凤(08生物科学)
指导老师:
刘金锋(讲师)
目录
1.摘要及关键词8
1.1.英文摘要8
1.2.中文摘要8
2.引言9
2.1.壳聚糖在食品领域的应用9
2.2.壳聚糖在医药领域的应用。
10
2.3.在农业中的应用现状10
3.材料与方法10
3.1.材料10
3.1.1土壤采集10
3.1.2培养基10
3.1.3主要试剂11
3.1.4主要仪器11
3.2试验方法11
3.2.1菌种筛选11
3.2.2.壳聚糖酶活力的测定12
3.2.3.孢子悬浮液的制备12
3.2.4.最佳碳源的确定13
3.2.5.最佳氮源的确定13
3.2.6最佳培养基初始pH值的确定14
3.2.7.最佳发酵时间的确定14
4.实验结果14
4.1初筛结果14
4.2复筛结果15
4.3壳聚糖酶活力测定16
4.3.1氨基葡萄糖标准曲线的绘制16
4.4菌株A8产酶条件的优化17
4.4.1碳源对产酶的影响17
4.4.2氮源对产酶的影响(表4)18
4.4.3培养基初始pH对菌株M19产酶能力的影响18
4.4.4培养时间对产酶的影响18
5.讨论19
参考文献19
中文文献19
外文文献19
1.项目的立项依据及当前国内外同类课题研究水平概述
项目的研究意义:
壳聚糖(chitosan)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖经过β-1,4糖苷键连接而成的线性聚合物,是迄今发现的自然界中唯一一种阳离子多糖,产量仅次于纤维素,具有抗菌、抗炎、抑制肿瘤生长和转移、免疫调节等多种独特的生物学功能[1~3]。
但由于分子量高,只溶于酸性环境,应用受到很大的限制。
研究表明,低分子量壳聚糖可溶于中性环境,并具有更加优良的生物学功能[4,5]。
目前低分子量壳聚糖的制备方法主要有化学法和酶法。
化学法反应条件十分苛刻,对环境污染较大,水解较难控制,产物转化率低,产品多为四糖以下的小片段。
酶法降解是在较温和的条件下进行的,降解过程不需要加入大量的反应试剂,产物的安全性高。
酶法降解可特异性地、选择性地切断壳聚糖的β-1,4糖苷键,降解过程和降解产物的分子量分布容易控制,易于得到所需分子量范围的低聚糖产品,反应专一性强,不会引起结构的破坏[6~8]。
然而,当前酶降解法所使用的酶活力不高,从而制约着在工业化生产中的应用。
因此,寻找一种能够高表达专一性壳聚糖降解酶的微生物菌株意义重大[9,10]。
本研究寻求不同微生物来源、高活性、专一性的壳聚糖酶,以期得到具有工业化应用价值的新酶原,并利用基因工程和诱变手段提高壳聚糖酶产量,开发丰富的壳聚糖资源,实现壳寡糖的规模化生产。
项目的现状分析:
壳聚糖酶(chitosanase)是专一性水解壳聚糖的酶,1973年Monaghan在研究细菌和真菌过程中发现,1992年被系统命名(chitosanase,EC31212199)。
近年来,国内外对壳聚糖酶都进行了大量的研究。
国外对壳聚糖酶研究已进入了分子水平,研究得最为深入的是BacilluscirculansMH-K1和StreptomycesspN174所产的壳聚糖酶,不仅基因被克隆,其三级结构和活性中心都进行的了研究;研究表明,壳聚糖酶对线性的壳聚糖具有水解专一性,为内切酶,多为诱导型,作用产物主要为2~6聚合度的壳寡糖;分布从细菌、放线菌、真菌、病毒到植物的广泛生物群中[11,12];国内对壳聚糖酶的研究主要的微生物有杀虫真菌球孢白僵菌,细菌属假单孢菌,青霉和曲霉,其催化性质、生理功能和基因结构也被深入研究。
经过国内外学者十几年的研究发现,许多微生物都可以产壳聚糖酶。
然而,迄今为止并没有发现真正产酶量大的可以用于工业化生产的菌种,对工业化的开发研究未见报道,酶解壳聚糖的研究还停留在实验室阶段[13,14]。
仍然需要在自然界中继续筛选产酶活性较高的微生物菌种,再根据传统思路对菌种进行诱变选育,然后对其发酵条件进行优化,以期获得产酶量更大的菌种及发酵生产条件。
2.项目的研究目标、研究内容以及拟解决的关键问题
(1)总体目标
获得一株高产稳定的壳聚糖酶生产菌株。
(2)研究内容
①菌种初筛
取不同来源土样,采用透明圈法进行菌种初筛,观察菌落的生长情况和生长圈大小。
②菌种复筛
取生长良好以及生长圈较大的菌落作为复筛的对象,借助酶活测定确定理想菌种。
③菌种纯化
用划线法和稀释倒平板法将上述分离出的菌株进行纯化,挑取单菌落接入斜面,进一步用摇瓶发酵检测酶活。
④菌种鉴定
菌落群体观察和个体观察,以及部分16srDNA或18srDNA序列分析。
⑤壳聚糖酶分离纯化及理化性质研究
采用DEAE-Cellulose离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析对壳聚糖酶进行分离和纯化,对纯化的壳聚糖酶SDS-PAGE电泳分析、酶活测定、质谱分析、氨基酸组成分析、氨基酸序列分析。
⑥壳聚糖酶对底物水解的特异性分析
⑦菌种诱变
取生长情况较好的单菌落,液体培养,当菌体进入对数生长期后,在紫外灯下照射进行菌种诱变。
⑧发酵条件优化
考察诱变筛选之后的菌种在不同的温度、不同的pH和不同的摇床转速下对菌体的产酶能力,并利用正交分析研究各因素对菌体产酶的影响程度,从而确定菌体产酶的最佳条件。
(3)拟解决的关键问题
筛选出产酶量大的可以用于工业化生产的菌种,并对其发酵条件进行优化。
3.拟采取的研究方法、技术路线和实验方案及可行性分析
(1)研究方法
拟采用采用透明圈法进行菌种初筛,借助酶活测定确定理想菌种;用划线法和稀释倒平板法将上述分离出的菌株进行纯化,挑取单菌落接入斜面,进一步用摇瓶发酵检测酶活。
拟采用部分16srDNA或18srDNA序列分析进行菌种鉴定;拟采用DEAE-Cellulose离子交换层析和SephadexG-100凝胶层析对壳聚糖酶进行分离和纯化,对纯化的壳聚糖酶SDS-PAGE电泳分析、酶活测定、质谱分析、氨基酸组成分析、氨基酸序列分析。
采用紫外诱变筛选高产菌株。
考察诱变筛选之后的菌种在不同的温度、不同的pH和不同的摇床转速下对菌体的产酶能力,并利用正交分析研究各因素对菌体产酶的影响程度,从而确定菌体产酶的最佳条件
(2)技术路线和实验方案
技术路线
实验方案
目前降解壳聚糖的方法主要有化学降解法和酶降解法两种。
酶降解法以其降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境没有污染等优点受到人们关注。
然而,迄今所使用的酶活力不高,对壳聚糖的降解效率不能令人满意,有必要找出一种新的高活性的壳聚糖酶。
我们拟从土壤里分离筛选出了一种可以产高活性壳聚糖酶的菌种,并对其的最佳产酶条件进行研究,为分离提取高活性壳聚糖酶打下了基础。
首先,从自然界中采集土壤样品,经筛选获得高活性壳聚糖酶的菌种,并鉴定种属,对该菌种进行紫外光诱变提高其的产酶能力,采用层析技术对活性成分分离、纯化,对其理化性质进行研究。
在此基础上设计优化产酶条件,利用先进的实验方法,优化出最适的产酶条件。
考察培养温度、摇床转速、培养基组成和装液量等培养条件对菌种产酶能力的影响,确定了该菌种的最佳产酶条件。
(3)可行性分析
①理论依据:
壳聚糖和淀粉、纤维素一样是自然界中含量很丰富的一种多糖。
众所周知,淀粉和纤维素的降解,工业上多采用酶法降解,酶法降解条件温和,产物的安全性高,不污染环境。
然而,迄今为止还没有发现产酶量较大的可用于工业化生产的壳聚糖酶菌株。
为此,仍需在自然界中继续筛选产壳聚糖酶活性较高的微生物菌种,再根据传统思路对菌种进行诱变选育,然后对其发酵条件进行优化,以期获得产酶量更大的菌种及其发酵生产条件。
②实验室条件:
本研究依托曲阜师范大学生物工程实验室,该实验室拥有本课题研究所需要的仪器和设备,该实验室老师具备丰富的微生物培养、菌种筛选、发酵工艺控制等专业知识。
项目中所涉及的有关其它试验方法在该研究室均甚成熟。
本研究小组已在该领域已经进行过初步的研究探索。
从而,完成本项目计划的内容是有保证的。
4.本项目的特色和创新之处
壳聚糖(chitosan)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖经过β-1,4糖苷键连接而成的线性聚合物,是迄今发现的自然界中唯一一种阳离子多糖,产量仅次于纤维素,具有抗菌、抗炎、抑制肿瘤生长和转移、免疫调节等多种独特的生物学功能。
但由于分子量高,只溶于酸性环境,应用受到很大的限制。
研究表明,低分子量壳聚糖可溶于中性环境,并具有更加优良的生物学功能。
目前低分子量壳聚糖的制备方法主要有化学法和酶法。
化学法反应条件十分苛刻,对环境污染较大,水解较难控制,产物转化率低,产品多为四糖以下的小片段。
酶法降解是在较温和的条件下进行的,降解过程不需要加入大量的反应试剂,产物的安全性高。
酶法降解可特异性地、选择性地切断壳聚糖的β-1,4糖苷键,降解过程和降解产物的分子量分布容易控制,易于得到所需分子量范围的低聚糖产品,反应专一性强,不会引起结构的破坏。
然而,当前酶降解法所使用的酶活力不高,从而制约着在工业化生产中的应用。
因此,寻找一种能够高表达专一性壳聚糖降解酶的微生物菌株意义重大。
本研究寻求不同微生物来源、高活性、专一性的壳聚糖酶,以期得到具有工业化应用价值的新酶原,并利用基因工程和诱变手段提高壳聚糖酶产量,开发丰富的壳聚糖资源,实现壳寡糖的规模化生产。
壳聚糖酶高产菌株的选育及培养条件的优化
王文爽窦春萌董冬秦姗姗杨永凤
(曲阜师范大学生命科学学院08生物科学,曲阜273165)
1.摘要及关键词
1.1.英文摘要
Abstract:
Themethodofsee-throughcirclewasusedtoscreenstrainsofproducingchitosanase.ThestrainnamedA8whichpossessedthehighestchitosanaseactivitywereobtained.ThestrainA8wasidentifiedasBacillusmegateriumby
physiologicalandbiochemicaltechniquesandsequenceanalyseof16SrDNA.TheformofstrainA8ispole,G-,fiagellumfromoneside.Theeffectofchitosanaseproducedonphytopathogensfungiwasstudied.Theresultsshowedthatchito-oligosaccharide
hadstronginhabitiononseveralkindsofphytopathogen.
Keywords:
Bacillus;chitosanase;screeningandoptimization;chito-oligosaccharide;
1.2.中文摘要
壳聚糖(Chitosan)由氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成,其常存在于真菌的菌丝和孢子梗或昆虫和甲壳类动物的外骨骼中。
壳聚糖经壳聚糖酶(Chitosanase)降解为壳寡糖后,降低了分子量同时改进了其溶解性能,使其易被生物机体吸收,可在医药、食品、精细化工、农业等众多领域中得到广泛的应用,前景倍受瞩目。
医药领域,壳寡糖具有免疫调节、降血脂、降血糖、降血压、排胆固醇、排毒素等众多生理作用;在食品领域,壳寡糖可作为食品添加剂来改良食品质构,增加保水性;在精细化工域,壳寡糖的保水性又可用于化妆品中,起到保湿、防皱以及消炎的功效;在农业领域,壳寡糖可作为植物生长调节剂和新型生物农药。
如抗细菌、抗真菌和抑制肿瘤的生长等……目前,制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法,化学降解法寡糖得率低,产物分离困难,而且对环境污染严重;酶解法具有反应条件温和、寡糖得率高和不造成环境污染等优点,是今后发展的方向。
降解壳聚糖的酶有非专一性酶和专一性酶,非专一性酶主要包括蛋白酶和脂肪酶等,作用机制尚不清楚。
壳聚糖酶(Chitosanase)是20世纪70年代初期发现的一种内切酶,对线性的壳聚糖具有水解专一性,酶解产物主要为2~6聚合度的壳寡糖。
壳聚糖酶主要存在于多种微生物及单子叶和双子叶植物的不同组织中,因此近年来研究者多数从土壤、海水和僵蚕等材料筛选产壳聚糖酶酶活较高的菌株。
本研究小组对采自三孔及南四湖土壤肥沃的土样进行了产壳聚糖酶菌株的筛选,并对酶活较高的菌株A8进行了鉴定,对其酶解产物壳寡糖对病原菌的抑制作用进行了研究。
并对其进行了紫外诱变,获得了更高产的菌株。
关键词:
壳聚糖;壳聚糖酶;应用;制备。
2.引言
2.1.壳聚糖在食品领域的应用
我国果汁澄清多是用酶法或过滤法,这些方法成本高、周期长。
若改用壳聚糖处理就能克服上述缺点。
壳聚糖还能净化糖汁,它能除去原料糖汁中的无机盐、纤维素、有机胶物质和一些悬浮物。
壳聚糖的抑菌作用可以对食品起防腐作用。
2.2.壳聚糖在医药领域的应用。
壳聚糖在抗心率失常、防治动脉粥样硬化、凝血作用和抗凝血作用、抗肿瘤作用以及抗感染作用等方面都有作用,而且其在做人造皮肤和外科手术缝合线上也表现出了广泛的应用前景。
2.3.在农业中的应用现状
用于土壤改良剂、果蔬保鲜剂、植物生长调节剂、种子包衣剂、植物病害抑制剂及饲料添加剂等
3.材料与方法
3.1.材料
3.1.1土壤采集
土样采自孔林周边及南四湖的土壤,共收集20份样品,采集后自然晾干后置于4℃冰箱保存。
3.1.2培养基
(1)初筛培养基:
(2)复筛培养基:
3.1.3主要试剂
培养基成分为市售分析纯和生化试剂;壳聚糖(食品级,脱乙酰度95%,分子量3000和20000两种,济南海德贝海洋生物有限公司甲壳食品有限公司生产)。
3.1.4主要仪器
恒温培养箱提压力蒸汽灭菌锅恒温振荡器电热炉超净工作台数显式电热恒温干燥箱分析天平特种电冰柜。
3.2试验方法
3.2.1菌种筛选
初筛:
称取2g土样,放入装有18mL无菌水的三角瓶中,震荡20min使样品充分打散后,静置10min,令其沉淀,取上清液约5mL,然后进行梯度稀释到10-6,分别在10-3,10-4,10-510-6浓度下各取1mL土壤稀释液制成混菌平板,每个浓度做3个平行样,将培养皿放入30℃培养箱中培养。
挑选出能在壳聚糖筛选培养基上产生透明圈的单菌落,接种到斜面培养基上,编号后放入冰箱冷藏。
复筛:
从冰箱中取出初筛得到的菌株,转接试管斜面活化,30℃下恒温培养4d.首先制成壳聚糖胶体筛选平板,用接种环沾取初筛得到的所有菌株分别划线植于壳聚糖复筛培养基上,放置在,30℃培养箱中,培养1d,取出后测量透明圈直径与菌落直径。
重复此过程3次,取平均值,选取透明圈直径与菌落直径比值最大的菌株作为出发菌株。
3.2.2.壳聚糖酶活力的测定
(1)氨基葡萄糖标准曲线的绘制:
分别吸取氨基葡萄糖(NAG)标准溶液(1mg/mL)0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL至10mL的离心管中,用蒸馏水补齐至1mL分别与1mL的DNS试剂混匀,沸水浴10min,流水冷却,再加蒸馏水定容至10mL在分光光度计下测A530值,以空白对照调零。
每个浓度测2个重复,取其平均值。
以氨基葡萄糖浓度作横坐标,不同浓度的氨基葡萄糖溶液的吸光度为纵坐标做标准曲线,并获得标准曲线的函数。
(2)酶活力的测定:
取发酵上清液500uL和500uLl1%的胶体壳聚糖溶液,37℃保温1h,加入DNS试剂1mL终止反应,并于沸水浴加热10min,流水冷却,加蒸馏水定容至10mL于A530测吸光度。
煮沸灭活的酶液同法处理作为对照。
酶活力单位定义为:
每毫升发酵液每分钟水解壳聚糖产生1mol氨基葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。
3.2.3.孢子悬浮液的制备
将已培养好的新鲜斜面菌种,用灭菌处理冷却后的生理盐水将斜面孢子洗下,3层无菌擦镜纸过滤,充分振荡30min,使孢子分布均匀,通过血球计数板计数控制孢子浓度,调整孢子悬浮液浓度为106个/mL。
3.2.4.最佳碳源的确定
取出发菌株制成孢子悬液,各取1mL孢子悬液,分别加入20mL4种碳源不同的培养基中。
(1)原始培养基配方;
(2)原始培养基配方+1%氨基葡萄糖;
(3)原始培养基配方+1%乳糖
(4)原始培养基配方+1%可溶性淀粉,
在30℃下摇床培养72h。
制成壳聚糖胶体平板,在适宜的地方贴滤纸片(直径为12mm),然后用移液枪取50µL霉菌发酵液,滴加在滤纸片上,每个样品做3个平行,然后30℃条件下恒温正置培养72h,观察并测量透明圈大小以确定最佳碳源。
3.2.5.最佳氮源的确定
取出发菌株制成孢子悬液,各取1mL孢子悬液,分别加入20mL4种已优化碳源但氮源不同
的培养基中。
(1)原始培养基配方(最佳碳源)+1%(NH4)2SO4;
(2)原始培养基配方(最佳碳源)+1%NH4NO3;
(3)原始培养基配方(最佳碳源)+1%蛋白胨;
(4)原始培养基配方(最佳碳源)+1%尿素,
在28℃下摇床培养72h,通过测量透明圈大小以确定最佳氮源。
3.2.6最佳培养基初始pH值的确定
取出发菌株制成孢子悬液。
各取1mL孢子悬液,分别加入初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0的已优化的液体培养基中,在30℃下摇床培养72h,通过测量透明圈大小以确定最佳初始pH。
3.2.7.最佳发酵时间的确定
取出发菌株制成孢子悬液,然后分别以最佳的接种量接入已优化的液体发酵培养基中,三角瓶中培养基的装量为最佳摇瓶装量,pH值为最适pH,在30℃下摇床分别培养24、36、72、96h,通过测量透明圈大小以确定最佳发酵时间。
4.实验结果
4.1初筛结果
将土样稀释液制成混菌平板培养,从二十批土样中共挑选出能在壳聚糖筛选培养基上产生水解圈的单菌落20株.然后分别将这20株霉菌编号A1-A20,接种到斜面培养基上,放入冰箱保藏以备复筛,菌落产生壳聚糖水解圈的情况见图1。
图1初筛结果
4.2复筛结果
将初筛得到的20个菌株分别用接种环沾取划线于壳聚糖复筛培养基平板上,在30℃条件下摇床培养1天。
重复此过程3次,分别测量菌落直径以及水解圈直径,并计水解圈直径与菌落直径的比值,所得数据见表1
表1复筛结果
菌种编号
菌落直径/mm
水解圈直径/mm
水解圈直径与菌落直径的比值
A1
13.6
26.2
1.93
A2
16.6
32.4
1.95
A3
11.4
20.9
1.83
A4
18.5
28.6
1.55
A5
17.0
32.8
1.94
A6
16.5
30.3
1.84
A7
16.7
30.3
1.81
A8
16.6
43.7
2.63
A9
19.5
33.6
1.72
A10
14.8
28.5
1.93
A11
17.8
31.0
1.74
A12
16.7
36.2
2.17
A13
17.2
34.7
2.02
A14
15.0
29.5
1.97
A15
18.5
29.7
1.61
A16
13.4
24.9
1.86
A17
12.4
26.5
2.14
A18
15.0
27.3
1.82
A19
15.2
26.5
2.01
A20
14.7
30.4
2.07
从表1结果可知,A8的产酶能力最强,将它作为出发菌株,从而进行菌株产酶条件的优化。
4.3壳聚糖酶活力测定
4.3.1氨基葡萄糖标准曲线的绘制
氨基葡萄糖标准曲线见图2
图2氨基葡萄糖浓度的标准曲线
根据标准曲线的函数得:
NAG(µg)=(A530+0.0003)/0.0005
NAG(µmol)=NAG(µg)/215.6(NAG分子量)
酶活力=NAG(µmol)*2(稀释倍数)/60(时间)
将20株真菌经发酵产酶培养基培养后,测定其酶活力,结果见表2。
菌种编号
酶活力(U/ml)
A1
0.30
A2
0.25
A3
0.19
A4
0.34
A5
0.27
A6
0.16
A7
0.48
A8
0.55
A9
0.36
A10
0.27
A11
0.38
A12
0.14
A13
0.24
A14
0.37
A15
0.19
A16
0.40
A17
0.25
A18
0.39
A19
0.49
A20
0.36
4.4菌株A8产酶条件的优化
发酵过程中影响菌株生长、产生代谢产物的主要因素为:
碳源、氮源、发酵培养基的初始pH
值、溶氧量、接种量和最适发酵时间,对上述因素进行全面考察,以确定菌株的最佳产酶条件。
4.4.1碳源对产酶的影响(表3)
表3碳源对产酶的影响
Table3Effectofcarbonsourceonchitosanaseproduction
碳源
壳聚糖
氨基葡萄糖
可溶性淀粉
乳糖
酶活力/UmL-1
1.89
1.43
0.88
0.68
从表3可以看出,以壳聚糖为碳源有利于该菌株产酶,。
4.4.2氮源对产酶的影响(表4)
表4不同氮源对产酶的影响
Table4Effectsofvariousnitrogenoussourcesonchitosanaseproduction
氮源
(NH4)2SO4
NH4NO3
蛋白胨
尿素
酶活力/UmL-1
1.91
1.32
0.86
0.67
表4氮源对产酶的影响
从表4可以看出,不同氮源对产酶的影响在不同菌种间有较大的差异性。
而在本实验中发现无机氮源比有机氮源更有利于产酶,无机氮源(NH4)2SO4最适合该菌产酶。
4.4.3培养基初始pH对菌株M19产酶能力的影响
Table5EffectofinitialpHvalueofmediumonchitosanaseproduction
初始PH
4
5
6
7
透明圈直径(mm)
27.4
30.9
32.3
29.7
由表5可见,培养基初始pH为6.0时产酶能力最强。
4.4.4培养时间对产酶的影响(表6)
Table6Effectsofculturetimeonchitosanaseproductio
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