TK1检测项目指导手册.docx
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TK1检测项目指导手册
第一部分项目运行意义概述
胸苷激酶1简称TK1,是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物;它参与DNA补救合成途径,是DNA合成的特殊标志酶。
临床上,可用于监测和评估体内细胞的异常增殖速度。
健康人细胞多处于静止状态(非增殖细胞),血清中的TK1酶含量极微,而随着增殖类疾病的发生,尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病,细胞发生过度增殖,血清中TK1酶的含量出现显著升高,超过健康人平均水平2倍甚至100倍以上。
所以,通过检测血清中TK1浓度水平的变化,能够敏感地发现细胞增殖异常,动态评估细胞增殖发展趋势,为提前干预治疗高风险癌前病变,遏制肿瘤进程提供重要信息。
在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖评审机构)二十多年的研发基础上,华瑞同康生物技术(深圳)有限公司与瑞典Karolinska大学TK1研究团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶1(TK1)细胞周期分析试剂盒及CIS系列化学发光数字成像仪,该系统是世界上唯一用于临床检验血清中TK1浓度的产品,其特异性高于95%,对各类增殖性疾病的综合检测灵敏度高于70%。
该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用:
1、独立的肿瘤预后因子:
多国家,多机构的研究表明,TK1是优选的预后评估指标,可作为独立的肿瘤预后因子;
2、动态评估手术、放化疗效果:
能够对各种实体肿瘤(例如:
肺癌,胃癌,结肠癌,直肠癌,食道癌,乳腺癌,宫颈癌,前列腺癌等)以及白血病和淋巴癌患者的治疗效果进行评估,为治疗方案的改善提供参考;
3、更早评估肿瘤复发风险:
对肿瘤康复期患者进行动态跟踪,较影像学更早提示肿瘤复发或转移风险信号;
4、评估各类增殖类疾病恶变风险:
处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。
基于TK1与细胞增殖的密切关系,能够灵敏地通过TK1的浓度变化,发现恶性增殖风险,为肿瘤的癌前干预提供了更有效率,更有价值的信息,适用于无疾病人群的恶性增殖风险筛查。
第二部分项目运行准备
一.项目环境
1、环境参数
温度:
24-25℃;
湿度:
小于65%;
实验用水:
(1)双蒸水;
(2)去离子水;
2、实验室设置要求:
(1)项目最小占地约8-9平方米;
(2)工作区域可放置两张1.5m×0.8m或一张3m×1m工作台;
(3)控温设备:
30立方米左右的独立空间,可选用2匹的挂式空调进行控温,或选用恒温摇床,如下图:
二、项目所需设备
1、实验用设备
编号
设备名称
规格要求
数量
用途
1
化学发光数字成像分析仪
CIS系列
1
采集发光信号和分析数据
2
脱色/恒温摇床(平摇)
20-100r/min可调
1
免疫孵育
3
台式离心机
0-4000r/min
1
分离血清
4
冰箱
冷藏2-8℃
冷冻-20℃
1
保存试剂
保存样本
5
打印机
USB数据接口
1
输出检测结果
6
恒温水浴锅
单孔或双孔
1
控制反应液温度
2、实验工具及耗材
(1)实验用工具:
编号
工具名称
规格要求
数量
用途
1
移液器
0-10μl或
1
血清点样
2
移液器
20-100μl
1
配制反应液
3
移液器
100-1000μl
1
分装和检测样本
4
试剂瓶
500ml
2
配制工作液
6
烧杯
100ml
2
配制工作液
7
电子计时器
无
1
实验提醒
8
探头温度计
-50℃-50℃
1
控制实验温度
9
塑料镊子
平头
1
实验需要
10
反应盒
24T、48T、96T
各1
适用于对应规格的产品使用
11
量筒
25ml
1
配制工作液
12
量筒
250ml
1
配制工作液
(3)实验耗材
编号
耗材名称
规格要求
用量
用途
1
移液器枪头
20μl
1个/样本
配套0-10μl移液器使用
2
移液器枪头
200μl
2个/次
配套20-100μl移液器使用
3
移液器枪头
1ml
1个/次
配套100-1000μl移液器使用
4
分装管
500μl或1ml
1个/样本
血清分装时使用
5
吸水纸
无
-
保持环境清洁,防止膜污染
6
精密PH试纸
5.5-9.0
-
测定缓冲液PH值
三、实验样本处理要求及保存
样本种类:
血清
采集要求:
1、必须使用无任何添加剂的真空采血管;
2、取静脉血2ml(室温);
3、建议空腹采血;
4、脂血、溶血样本可能造成实验结果的偏差,不建议使用;
样本处理:
1、采血完成后,室温下静置或37℃水浴至凝固后离心使用;
2、离心转速:
4000r/min,离心时间:
5min;
注:
室温放置时间不宜超过3h;
样本保存:
1、离心后的血清如非即时使用,应立即分装,推荐血清分装量100-200μl/管,放置于-20℃保存;
2、-20℃保存时间以不超过7天为佳;
3、如需长时间保存,建议提高分装量(1.5ml),并放置于-80℃(可保存3年左右);
样本运输:
1、样本如需外送检验(本市范围内或行程小于3小时),建议采血后先放置于2-8℃静置,到检验点后取出离心,处理要求同上;
2、样本如需外送检验(外省市),建议离心后分装至分装管中,血清分装量1.5ml/管,运输介质建议使用保温箱+化学冰+干冰,干冰用量2公斤/24小时(根据路程耗费时间增量);
样本复融:
1、血清使用前需充分振荡混匀;
2、冷冻保存的血清样本,需放置于室温完全解冻后使用;
3、反复冻融的血清样本严禁使用。
第三部分项目核心产品简介
一、胸苷激酶1细胞周期分析试剂盒
注册号:
粤食药监械(准)字2014第2400369号
规格:
24人份、48人份、96人份
储存条件:
2-8℃
有效期:
6个月(具体日期见试剂盒标签)
使用要求:
开封后一次性使用
实验用时:
单次实验用时5-6h(根据样本数量有所差别);
工作通量:
300-400人份/天
图1
主要组成成份:
试剂盒由校准品、抗TK1-IgY、生物素化抗IgY二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、封闭剂、硝酸纤维素膜主要成分组成。
组分名称、装量详见产品说明书,并以产品说明书为主。
二、CIS系列化学发光数字成像分析仪
注册号:
粤食药监械(准)字2011第2400879号
1、设备性能参数
●系统偏差:
±5%
●成像灰度等级:
12bit(212)
●分辨率:
1392(H)×1040(L)
●光学镜头:
几何形变率小于1%
●拍摄范围:
12cm×9cm可调
●工作环境温度:
10-30℃
●单次批处理能力:
96人份/次
●读出噪音:
≤7e-rms@20MHz
●降噪能力:
专业级高效半导体制冷CCD,集成噪音软处理功能
2、主要结构部件
CIS-2化学发光数字成像分析仪、免疫点印迹分析软件、加密狗、Lenovo一体机。
图2
第四部分项目实验操作
一、项目原理概述
1、TK1检测:
先将含有TK1抗原血清吸附在硝酸纤维素膜固相载体上,用抗人TK1-IgY抗体识别抗原(A),生物素化抗IgY二抗识别抗原-抗人TK1-IgY抗体并进行信号放大(B),亲和素化辣根过氧化物酶与生物素连接(C),在加入发光底物后,亲和素化辣根过氧化物酶催化底物发光,发出的光信号强弱光信号(D),必须通过CCD的信号采集设备进行采集和分析。
(如图3)
图3
2、实验结果分析:
将反应完毕的样本载体,放入暗室(避免外界光的干扰),通过精密的制冷CCD长时间曝光将化学发光强弱信号转变为数字信号,保存后得到样本发光图片,通过校准品固定浓度与亮度的关系,绘制标准曲线,进而计算出其他样本TK1的浓度。
二、实验操作流程
1、实验准备部分:
1.1血清准备:
请参照《实验样本处理要求及保存》章节;
1.2试剂工作的最佳温度为25-26℃,请使用空调和恒温水浴锅等保证实验工作液温度达到该标准;
1.3实验前需仔细清洗玻璃器皿:
洗涤液清洗→清水冲洗→实验用水润洗
1.4检测实验用设备和工具是否都处于正常工作状态(包括化学发光数字成像分析仪),对于发现的异常情况进行及时排除;
1.5按照说明书要求配制实验所需的稀释液和洗涤液,保证配制好后的pH值在7.2-7.8之间;
2、实验操作控制
1、点样:
取出点样板,为防止污染在点样板下放一张白纸,样本上样量为3μl;
a.取样后,枪头贴壁2-3次;b.加样枪垂直;c.扶稳加样枪,枪头固定于孔中央;d.保证样本打出后直接被膜吸附;
2、晾干:
将膜从点样板中取出,揭掉背面蓝色保护膜,放置于温度28-30℃,湿度小于65%的环境进行晾干,时间为30min;
3、漂洗:
待膜晾干完毕,将膜放入反应盒,倒入双蒸水或去离子水,使膜浸没于水中,以60-70r/min的转速洗涤2次,每次1min;
4、封闭:
封闭剂使用稀释液配制(3g封闭剂+50ml稀释液);使用磁力搅拌器混匀5min(或用手快速搅匀10-15min),至没有封闭剂颗粒和沉淀为止;将晾干后的膜放入反应盒中,倒入封闭剂;以35-45r/min的转速摇动,时间为30min;
5、抗TK1-IgY抗体反应:
将封闭液摇匀(盒底无沉淀)后倒出,然后加一抗反应液(一抗稀释浓度见试剂盒内说明书),并以400μl封闭剂/10ml反应液的比例添加封闭剂;以35-45r/min;反应2h;反应液温度控制在25℃左右;
6、洗涤:
倒去一抗反应液,先用洗涤液迅速漂洗两次,再倒入洗涤液以60-70r/min的转速洗涤3次,每次5min;
7、生物素化抗IgY二抗:
按说明书稀释倍数进行稀释,35-45r/min反应40min;反应液温度控制在25℃左右;
8、洗涤同6
9、SA-HRP:
按说明书稀释倍数进行稀释,35-45r/min反应60min;反应液温度控制在25℃左右,
10、洗涤同6
11、ECL发光:
取出洗涤好的膜,在吸水纸上控干后放在发光盒中,将ECL1、2液混合后均匀倒在膜上,计时反应1min,反应完成后,立即开始倒计时5min,将膜夹入压膜片中,用滚筒压平,放入化学发光仪中调整位置(十字交叉中心),关闭暗箱门,5min倒计时结束后进行拍摄。
三、实验结果分析
1、工作前准备:
1.1连接好电源,启动设备(可在拍摄前5min启动);
1.2运行免疫点印迹分析软件;在登录界面输入用户、密码后,进入软件操作页面(异常情况1)。
2、实验结果获取流程
2.1预拍
将实验膜片放入化学发光仪中调整位置(十字交叉中心),关闭样本台;点击工具栏“系统”——选择“读取CCD”,或者点击快捷按钮——单击“预拍”。
2.2实验图像的获取:
预拍结束后点击“读取图像”,即开始读取图像,读取完毕后会弹出“实验图片拍摄完毕,请取出模板”的提醒(异常情况2),取出膜片后,重新关闭样本台,点击“读取背景图像”,倒计时结束后点击“应用”;
2.3实验图像的处理
点击“应用”,软件即会对图像自动进行背景扣除并自动压缩显示范围,生成结果图像,点击“关闭”关闭CCD对话框。
2.4实验图像的保存
点击“图像”——“另存待分析图像(pwk)”,或快捷按钮,选择保存位置保存待分析图像后关闭图像,所保存的文件后缀名为“pwk”,保存后关闭分析仪电源。
建议:
每天的实验结果建议保存在独立的文件夹,文件夹命名规则:
实验时间+试剂批号,例如:
20131212-NT1131101A
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