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医学论文戊糖片球菌生理特性的研究

戊糖片球菌生理特性的研究

摘要：

【目的】对戊糖片球菌的生长曲线、糖的消耗量及产酸趋势等生理特性的研究。

【方法】以MRS培养基为空白对照，自接种后，每隔2h取样，测定该菌悬液在600nm波长下的OD值，以培养时间为横坐标，以600nm处的OD值为纵坐标，绘制出戊糖片球菌的生长曲线；以葡萄糖的标准曲线为依据，采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定戊糖片球菌对葡萄糖的消耗趋势；根据戊糖片球菌以葡萄糖为碳源产酸不产气的特性，应用pH计测定戊糖片球菌各生长阶段所处环境的pH值，绘制戊糖片球菌发酵过程中pH变化趋势，以此推断其产酸趋势。

【结果】戊糖片球菌在适宜培养基条件下培养至10h，其活菌数达到最高；培养到4h~16h戊糖片球菌的耗糖趋势明显增强，同时，培养基pH降低的速率也非常快，之后伴随着菌体数量的减少，糖浓度和pH值曲线趋于平衡。

【结论】10h为戊糖片球菌的最佳生长收获期。

关键词戊糖片球菌；生长曲线；耗糖量；乳酸；产酸趋势

StudiesonthePhysiologicalCharacteristicsofTabacillusPentosans

MingyuZHANG

（DepartmentofLifeSciences,DezhouUniversity,Shandong,253023）

Abstract【Objective】Tostudythegrowthcurve,sugarconsumptionandacidproductiontrendofS.pentosans.【Methods】TheODvalueofbacterialsuspensionat600nmwavelengthwasmeasuredevery2hoursafterinoculationwithMRSmediumasblankcontrol.ThegrowthcurveofTapivacoccuspentosaewasplottedwiththeODvalueat600nmasabscissaandtheODvalueat600nmaslongitudinalcoordinate.Basedonthestandardcurveofglucose,theconsumptiontrendofTapivacoccuspentosaewasdeterminedby3,5-Dinitrosalicylicacidcolorimetry.AccordingtothecharacteristicsofS.Pentosansproducingacidandnogaswithglucoseascarbonsource,thepHvalueoftheenvironmentateachgrowthstageofS.PentosanswasdeterminedbypHmeter,andthechangingtrendofpHvalueduringthefermentationprocesswasplotted,soastoinfertheacidproductiontrendofS.pentosans.【Result】ThenumberofviablebacteriaofS.Pentosansreachedthehighestwhenculturedinsuitablemediumfor10h,andthetrendofsugarconsumptionincreasedsignificantlyfrom4hto16h.Atthesametime,therateofreducingthepHofculturemediumwasveryfast.Ｆollowedbythedecreaseofthenumberofbacteria,thecurveofsugarconcentrationandpHvalue.Towardsbalance.【Conclusion】10histhebestharvesttimeforthegrowthofS.pentosans.

KeywordPediococcuspentosae;Growthcurve;Sugarconsumption;Lacticacid;Acidproductiontrend

1引言

1.1戊糖片球菌及其研究背景

1.1.1戊糖片球菌的生物学特性

　　戊糖片球菌（P.pentosaceus），隶属于片球菌属，是乳酸菌的一种，为革兰氏阳性菌，细胞球形，直径0.8~1.0µm，非孢子形状，兼性厌氧，成对或四联状，少数为单个细胞，多数联成一片，不运动。

菌落呈圆形，乳白色，表面光滑凸起，边缘整齐,不透明。

戊糖片球菌的生长需要多种营养，生长温度范围13℃~45℃，最适生长温度为35℃，最高生长温度为42~45℃。

戊糖片球菌能发酵多种糖产酸不产气，如蔗糖、葡萄糖等，无蛋白水解作用，对啤酒花防腐剂敏感。

主要分布于麦芽汁和发酵植物材料中，如酸腌菜、泡菜、青贮料中。

1.1.2戊糖片球菌的生理作用

1）抑制致病菌的增殖

戊糖片球菌生长可分泌细菌素直接杀伤致病菌，其自身代谢可产生大量有机酸，渗入致病菌细胞膜，降低胞内pH抑制代谢，从而可以抑制致病菌毒力因子基因表达；同时，通过与致病菌竞争肠上皮细胞黏附位点，抑制致病菌黏附，还可与致病菌凝集在一起，使其无法发挥致病作用，进一步达到抑制致病菌增殖的目的。

2）调节肠道免疫

戊糖片球菌隶属于乳酸菌，是一种益生菌，大量研究表明，益生菌可以通过增强系统和局部免疫功能，提高机体抗病能力。

其免疫调节作用的机制主要是通过调节免疫器官和细胞产生的细胞因子的表达和分泌，从而发挥免疫调节作用。

全基因组序列分析检测结果显示，戊糖片球菌基因组中含有编码特异性肽聚糖和γ-氨基丁酸的基因，这两种物质对免疫调节具有重要作用，以此揭示了戊糖片球菌免疫调节作用的分子基础。

3）降低胆固醇

胆固醇在机体内具有多种生理功能，但血液中胆固醇升高是冠心病发生的重要因素。

体内外实验研究表明，戊糖片球菌可显著抑制胆固醇的吸收，降低血液中胆固醇含量。

其作用机制主要是同化胆固醇。

同时，戊糖片球菌具有胆盐水解酶活性，将胆盐水解产生游离胆酸排出体外，胆固醇则可以转化为胆酸用于补偿这部分损失，从而降低胆固醇吸收。

4）减少体脂沉积

近年来，人类肥胖症的发病率逐年提高，对畜禽生产提出了更高的要求，目前，戊糖片球菌作为微生态饲料添加剂的一种，其在提高和促进动物生长性能和增强免疫力等方面发挥重要作用，而在减少畜禽体质沉积方面少有研究报道，因此，开发安全、高效的饲料添加剂产品，从营养的角度降低动物的体脂沉积、提高瘦肉率是饲料工业发展的重要方向之一。

5）抗肿瘤

癌症是目前全球死亡率最高的疾病，众多研究发现，戊糖片球菌可有效抑制癌细胞增殖。

其抗肿瘤机制尚不明确，据推测可能主要通过分泌有机酸诱导肿瘤细胞凋亡，同时，产生的葡聚糖修饰膜表面蛋白可降低肿瘤细胞黏附，抑制细胞铺展和转移。

1.1.3戊糖片球菌的应用

1）食品科学领域的应用

在食品加工过程中，通过微生物发酵作用，使食品原料发生一系列复杂的生物化学变化，从而可改善食品的营养价值、色泽、质地、风味等，且在提升产品品质、保证食用安全性、提高生产效率等方面有积极作用。

2）动物生产中的应用

在动物生产中，李念珍、王浩等实验研究表明将戊糖片球菌菌剂添加至饲料中,在保障畜产品安全的前提下,可有效地调节胃肠道内的菌群，显著提高家禽的饲料转化效率、生长性能和产肉性能，在一定程度上改善机体的免疫功能，增强抵抗致病菌感染的能力，产生有益的代谢产物，起到预防和治疗疾病的作用。

3）青贮饲料加工中的应用

在青贮饲料加工中，新鲜的青绿饲草经乳酸菌在厌氧条件下发酵，而形成一种适口多汁、气味酸香、营养丰富的主要用于喂养反刍动物的饲料。

有机酸的产生，使pH下降，抑制有害微生物生长繁殖，从而利于长期保存。

研究表明，苜蓿青贮饲料发酵过程中的固有乳酸菌菌株就是戊糖片球菌。

微生物青贮添加剂通常是由几种乳酸菌、酶和一些营养成分组成的，这对于促进乳酸菌大量增殖、发酵产生乳酸加快、促进多糖和粗纤维的转化、提高营养成分含量等有重要作用。

戊糖片球菌因在食品加工、动物生产、青贮饲料加工等方面显现其优势，故被广泛应用于食品、畜牧、医疗保健等领域，其益生功能越来越受到关注和重视。

1.2戊糖片球菌对糖的利用

1.2.1糖消耗量的测定方法

戊糖片球菌可利用葡萄糖发酵产生有机酸，葡萄糖属于还原糖，还原糖是指含有醛基或酮基的单糖和某些二糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖等），在碱性条件下，可以还原Cu2+等金属离子，自身被氧化。

这一性质常被用于定性和定量测定，因此戊糖片球菌产酸发酵过程中，发酵液中还原糖的含量是发酵程度的一个重要指标。

常用的还原糖测定方法有3,5-二硝基水杨酸比色法、斐林试剂法、还原糖测定仪法等，其中3,5-二硝基水杨酸比色法具有操作简单、准确度高、重现性好、检测快速等优点，该方法适用于大批量样品的测定，因而被广泛用来测定发酵液中的残余糖量，从而得出细菌在生长和代谢过程中的耗糖量。

1.2.23,5-二硝基水杨酸比色法的原理

碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖在加热条件下被还原为氨基化合物，该物质在过量的NaOH溶液中呈现棕红色，在540nm波长下具有最大的光吸收，在一定范围内，还原糖的含量与反应液的颜色成正比，与所测得的吸光度成线性关系，所以可以根据所测得吸光度来计算出样品中还原糖的含量。

因此，本实验采用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定戊糖片球菌各生长阶段对糖的利用情况，并以此绘制出戊糖片球菌消耗糖的大体趋势。

1.3戊糖片球菌的代谢产物

1.3.1乳酸的概述

戊糖片球菌能够发酵多种糖，产酸不产气，其主要代谢产物是乳酸（lacticacid），化学名称为2-羟基丙酸，分子式为CH3CH（OH）COOH，是一种含有羟基和羧基的有机酸，该物质广泛存在，是世界上公认的三大有机酸之一，是食品工业中的重要调味剂和防腐剂，也是医药、化工等工业生产上的重要原料。

1.3.2戊糖片球菌产酸趋势的测定方法

主要测定方法有：

酸碱滴定法、酶电极法、气相色谱法、液相色谱法等。

高效液相色谱法因其准确、快速、简便而成为测定乳酸的理想方法。

付卫明等人采用高效液相色谱法对米根霉发酵液体系进行了乳酸分析，其利用无机氮源即可以生长，因而其发酵液成分简单，可采用紫外/可见波长检测器在210nm处分析其产物乳酸。

而戊糖片球菌的营养要求复杂，其中酵母膏和蛋白胨所含有的各种氮源、糖类、脂类及维生素等成分在紫外波长范围内均有较强的吸收，因而戊糖片球菌乳酸发酵液中的乳酸无法采用紫外/可见分光光度法进行检测。

因此，本实验采用pH计测定戊糖片球菌各生长阶段发酵液的pH，根据pH的变化趋势，建立和分析戊糖片球菌乳酸发酵液中的产酸趋势，这对于研究微生物菌株的代谢调控、改良菌种和优化发酵工艺条件，从而提高发酵液中有机酸的产量具有重要的意义。

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌种

戊糖片球菌（pediococcuspentosaceus）由山东大学微生物重点实验室提供。

2.1.2主要试剂

葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，无水乙酸钠，柠檬酸二铵，磷酸氢二钾，吐温80，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，氢氧化钠，冰醋酸，75%乙醇，琼脂粉，3,5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠等。

2.1.3主要实验器材

显微镜，紫外分光光度计，电子分析天平，超净工作台，台式离心机，超低温冰箱，高压蒸汽灭菌锅，超纯化水机，微量移液抢，恒温培养箱，培养皿，锥形瓶，烧杯等。

2.2方法

2.2.1MRS培养基的配制

活化采用MRS液体培养基；分离采用MRS+0.5%CaCO3固体培养基。

MRS培养基配方（lL）：

葡萄糖20g；蛋白陈10g；牛肉膏10g；酵母膏5g；无水乙酸钠5g；柠檬酸二铵2g；K2HPO42g；MgSO4·7H2O0.58g；MnSO4·4H2O0.25g；Tween801ml；琼脂20g；用冰醋酸和40%NaOH溶液调pH至6.2~6.4，121℃灭菌15min。

2.2.2菌种活化

将戊糖片球菌菌种从-80℃超低温冰箱中取出，室温放置融化后，接种于MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜后，取适量菌悬液接种于MRS+0.5%CaCO3固体培养基上，待长出菌后再挑取单菌落平板化纤分离，进一步纯化。

2.2.3菌种鉴定

1）固体培养特征

在37℃条件下培养24h后，P. pentosaceus在MRS十0.5%CaCO3固体培养基上生长良好，菌落呈规则的圆形，乳白色，表面光滑凸起，边缘整齐，不透明。

戊糖片球菌固体培养形态特征如图2-1所示。

图2-1戊糖片球菌固体培养形态特征

Figure2-1MorphologicalcharacteristicsofsolidcultureofS.Pentosans

2）液体培养特征

在无菌条件下，用接种针挑取纯化的单菌落于澄清的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，细菌迅速而均匀地生长，达到最大浑浊度后，菌体逐渐沉淀到锥形瓶底部，菌体呈乳白色。

3）细菌形态鉴定

在洁净的载玻片中央滴一滴无菌水，用接种环挑取单菌落与玻片上的水滴混合均匀，自然风干形成一层薄的菌膜。

在微火上通过3次使菌体固定，待冷却后进行染色。

首先加结晶紫1~2滴，初染1~2min，倾去染料，用蒸馏水冲洗至无色；再加碘液媒染1~2min，蒸馏水冲洗后，用吸水纸吸去水分；滴加95%乙醇并轻轻晃动进行脱色，倾去乙醇，重复2-3次，立即水洗，以终止脱色。

最后滴加沙黄复染2-3min，水洗，最后用吸水纸吸干，待观察。

经革兰氏染色与光学显微镜（100×）下观察，细胞球状，成对或四联状排列，少数为单个细胞，多数联成一遍，不运动，为革兰氏阳性菌。

其形态特征如图2-2所示。

图2-2戊糖片球菌在光学显微镜（100×）下的形态特征

Figure2-2MorphologicalcharacteristicsofStaphylococcusPentosansunderopticalmicroscope（100*）

2.3生长曲线的测定

将活化的菌种以2%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，自接种后，以MRS培养基为空白对照，每隔2h取样，测定P. pentosaceus菌悬液在600nm波长下的OD值，以培养时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制出戊糖片球菌的生长曲线图。

2.43,5-二硝基水杨酸比色法测定戊糖片球菌的耗糖量

2.4.1试剂的配制

（1）1mol/L的NaOH溶液：

取0.40g的NaOH固体粉末溶解于100ml的蒸馏水中即可配制成1mol/L的NaOH。

（2）3,5-二硝基水杨酸溶液：

称取3,5-二硝基水杨酸1.00g，溶解于20ml1mol/LNaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，上述物质溶解后，再加入30.00g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释到100ml，密封保存。

（3）葡萄糖标准溶液的配制：

取1.00g葡萄糖，加蒸馏水使其充分溶解，用100ml的容量瓶定容，得到10mg/ml的葡萄糖标准溶液；再分别取该溶液适量，用蒸馏水定容到25ml，从而得到1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml的葡萄糖标准溶液。

如表2-1所示。

表2-1葡萄糖标准溶液的配制

Table2-1PreparationofGlucoseStandardSolution

葡萄糖浓度（mg/ml）

1

2

4

6

8

10mg/ml的葡萄糖溶液（ml）

2.5

5

10

15

20

蒸馏水（ml）

22.5

20

15

10

5

2.4.2标准曲线的绘制

取1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml的葡萄糖标准溶液各1ml分别置于25ml的容量瓶中，各加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml，在沸水浴中加热2min，显色后用流水迅速冷却，用蒸馏水定容到25ml，混合均匀。

以蒸馏水为空白调零，于540nm处测定不同浓度葡萄糖溶液的吸光度。

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线（如图2-3所示）。

葡萄糖含量（mg/ml）与相应的吸光值（A）有一定的线性关系，且其回归方程为y=0.1667x+0.1366，相关系数R2=0.99。

图2-3葡萄糖标准曲线

Figure2-3GlucoseStandardCurve

2.4.3样品预处理

以2%的接种量将活化的菌种接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养30h，自接种后，每隔2h取5ml发酵液6000r/min离心10min，后取上清液1ml加2mlDNS，沸水浴中加热2min进行显色，用流水冷却，最后用蒸馏水定容到25ml即得到待测液。

2.4.4测定方法

通过测定每个样品在540nm处的吸光值，利用葡萄糖标准曲线计算样品中还原糖的含量，即为菌体各生长阶段的残糖量，已知MRS液体培养基中葡萄糖的初始含糖量为20mg/ml，根据耗糖量=初始糖量—残糖量，计算出耗糖量。

2.4.5数据处理

每个样品测三个平行，用EXCAL中的函数计算数据平均值和戊糖片球菌生长个阶段培养基中的残糖量，从而进一步了解戊糖片球菌生长过程中的耗糖量情况。

2.5利用pH计测定戊糖片球菌的产酸趋势

2.5.1pH计的工作原理

pH计，又称酸度计，是利用原电池原理来测定溶液pH的一种仪器。

pH计广泛应用于工业、农业、科研、环保等领域。

pH计主要由参比电极、玻璃电极和电流计三个部件构成。

参比电极作为测量各种偏离电位的对照，维持一个恒定的电位；玻璃电极可以对所测溶液的氢离子活度发生的变化作出反应；电流计通过指针偏转的程度表示信号的强度，通常pH电流表的表盘刻有相应的pH数值，以方便读数。

pH计的种类很多，主要有台式酸度计、便携式pH计、笔式酸度计三大类别。

本次实验应用笔式pH计测定戊糖片球菌各生长阶段的酸碱环境，绘制戊糖片球菌的pH变化趋势，以此推断戊糖片球菌的产酸趋势。

2.5.2样品预处理

以2%的接种量将活化的菌种接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养48h，自接种后，每隔2h取5ml发酵液6000r/min离心10min，弃沉淀，其上清液即为待测样品。

2.5.3产酸趋势的测定方法

取下保湿瓶，用蒸馏水冲洗pH计的电极，并用滤纸将水分吸干；将电极浸入pH6.8的磷酸缓冲溶液晃动后静止放置，按“CAL”键，屏幕上显示的即为校正溶液的pH值；取出电极用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干后浸入待测样品中，晃动后静止放置，显示稳定后读数即为待测样品的pH值。

使用完毕，清洗电极，关闭开关，套上保湿瓶。

2.5.4数据处理

每个样品测三个平行，用EXCAL中的函数计算数据平均值，绘制戊糖片球菌的pH变化趋势，以此推断戊糖片球菌的产酸趋势。

3实验结果与分析

3.1戊糖片球菌的生长曲线

实验研表明，P. pentosaceus在0h~4h增殖缓慢，处在细菌生长的延滞期；4h~10h细菌生长迅速，活菌数以指数增长，为对数增长期；10h~16h由于培养基中营养物质的减少，有害代谢产物的积聚，细菌繁殖速度减慢，死亡数目增加，生长菌群总体处于平稳状态，是细菌生长的稳定期；16h过后，随着培养时间的延长，死亡菌数明显增多，增殖速率越来越慢，活菌数越来越少，为衰亡期。

戊糖片球菌在最适培养条件下的生长曲线如图3-1所示。

图3-1戊糖片球菌在最适培养条件下的生长曲线

Figure3-1GrowthCurveofStaphylococcusPentosansunderOptimumCultureConditions

3.2戊糖片球菌的耗糖量

通过测定每个样品在540nm处的吸光值，利用葡萄糖标准曲线计算样品中还原糖的含量即为P. pentosaceus各生长阶段的残糖量，已知MRS液体培养基中葡萄糖的初始含糖量为20mg/ml，根据耗糖量=初始糖量—残糖量，计算出戊糖片球菌的耗糖量。

测定数据如表3-1所示。

表3-1戊糖片球菌各生长阶段葡萄糖的使用情况

Table3-1GlucoseUseinStaphylococcusPentosaeatDifferentGrowthStages

发酵时间

（h）

吸光度

平均值

待测液的糖浓度

（mg/ml）

残糖量（mg/ml）

耗糖量（mg/ml）

2

0.2663

0.7782

19.4561

0.5439

4

0.2617

0.7502

18.7562

1.2438

6

0.2593

0.7363

18.4063

1.5937

8

0.2523

0.6943

17.3565

2.6435

10

0.2567

0.7203

18.0064

1.9936

12

0.2417

0.6303

15.7568

4.2432

14

0.2233

0.5203

13.0074

6.9926

16

0.2223

0.5143

12.8574

7.1426

续表3-1

发酵时间

（h）

吸光度

平均值

待测液的糖浓度（mg/ml）

残糖量（mg/ml）

耗糖量（mg/ml）

18

0.1623

0.1544

3.8592

16.1408

20

0.1620

0.1524

3.8092

16.1908

22

0.1537

0.1024

2.5595

17.4405

24

0.1523

0.0944

2.3595

17.6405

26

0.1533

0.1004

2.5095

17.4905

28

0.1527

0.0964

2.4095

17.5905

30

0.1527

0.0964

2.4095

17.5905

根据戊糖片球菌各生长阶段葡萄糖消耗情况的数据显示，绘制残糖量和耗糖量的趋势图。

如图3-2所示，0h~10h为细菌生长的延滞期和对数增长期，此时培养基中葡萄糖的浓度变化趋势平缓；10~16h生长菌群总数处于平坦阶段，由于营养物质大量消耗，培养基中葡萄糖的浓度变化明显，呈大幅度下降的趋势；16h过后为细菌的衰亡期，活菌数较少，培养基中葡萄糖浓度达到最低。

图3-2戊糖片球菌发酵过程中耗糖量趋势图

Figure3-2TrendChartofSugarConsumptionintheFermentationofPediococcusPentosae

3.3戊糖片球菌的产酸趋势

由图3-3可以看出，戊糖片球菌生长的初始pH