USP292s 62非无菌产品的微生物检查特定微生物的检查 中文译稿doc.docx
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增加下述:
(62)非无菌产品的微生物检查:
特定微生物的检测
序言
本文中所描述的实验将在规定的条件下,确定没有特定的微生物,或存在有限的特定微生物。
设计此试验主要是为了确定某种原料药和制剂的微生物质量是否符合已制定的质量标准。
当作此用途时,遵循下面给出的说明,包括采样编号,并按照下面的说明解释结果。
也可以使用其它的微生物规程,包括自动化方法,只要它们和已经证明的药典方法等效。
通用规程
按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验(61)中所述制备样品。
如果供试品中有抑菌活性,尽可能按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验(61)中所述去除或中和。
如果使用表面活性剂制备样品,则必须按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验(61)中所述证明其对微生物的无毒性,以及与其它灭活剂的相容性。
培养基的促生长和抑制性与试验的适用性
必须建立实验检出供试品中所含微生物的能力。
如果试验操作或产品方面引入了可能影响试验结果的变更,则必须确认适用性。
试验菌株的制备
使用标准化的稳定试验菌悬液,或者按下述说明制备。
使用种子批培养保存技术(生产菌种系统)以便从原始主种子批中取出用于接种的活菌传代不超过5次。
好氧微生物
在30°到35°使每种试验菌株在含在大豆-酪蛋白消化肉汤或大豆-酪蛋白消化琼脂的容器内生长18到24小时。
白色念珠菌则单独在20°到25°的沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤上生长2到3天。
Staphylococcusaureus
金黄色葡萄球菌
suchasATCC6538,NCIMB9518.CIP
4.83,orNBRC13276
如ATCC6538,NCIMB9518.CIP
4.83,或NBRC13276
Pseudomonasaeruginosa
铜绿假单胞菌
suchasATCC9027,NCIMB8626,CIP
82.118,orNBRC13275
如ATCC9027,NCIMB8626,CIP
82.118,或NBRC13275
Escherichiacoli
大肠杆菌
suchasATCC8739,NCIMB8545,CIP
53.126,orNBRC3972
如ATCC8739,NCIMB8545,CIP
53.126,或NBRC3972
Salmonellaenterica
ssp.entericaserotypetyphimurium
or,asanalternative,
沙门氏菌
suchasATCC14028
如ATCC14028
Salmonellaenterica
ssp.entericaserotypeabony
沙门氏菌
suchasNBRC100797,NCTC6017,orCIP80.39
如NBRC100797,NCTC6017,或CIP80.39
Candidaalbicans
白色念珠菌
suchasATCC10231,NCPF3179.IP48.72,
orNBRC1594
如ATCC10231,NCPF3179.IP48.72,
或NBRC1594
使用pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2的磷酸盐缓冲液制备试验悬液。
在2小时内使用悬液,如果在2°到8°保存,可在24小时内使用。
梭菌
使用如ATCC11437(NBRC14293,NCIMB12343,CIP100651)或ATCC19404(NCTC532orCIP79.3)的产孢梭菌。
使梭菌的试验菌株在梭菌的补充培养基中的无菌条件下30°到35°生长24到48小时。
制备,然后稀释梭菌孢子的营养细胞新鲜悬液替代选择,是用一个稳定的孢子悬液进行试验接种。
稳定的孢子悬液可在2°到8°保存,保存时间是一个经过验证的时间。
。
阴性对照
为了验证试验条件,用所选稀释液代替试验样品作为阴性对照。
其中不得有微生物生长。
培养基的生促生长和抑制性
对每批现成的培养基及每批由脱水培养基或成分制备的培养基进行试验。
按表1所述验证相关培养基的适用性。
促生长试验,液体培养基—在一份适宜的培养基上接种少量(不超过100cfu)的适当微生物。
在规定温度下培养,培养时间不得超过试验规定的最短时间。
可见微生物明显生长,其结果与早先用过去试验过并获批准的培养基得到的结果相当。
促生长试验,固体培养基—进行表面铺展法(见非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>下的平板计数法),用少量(不超过100cfu)适当微生物接种各平板。
在规定温度下培养,培养时间不超过试验规定的最短时间。
可见微生物明显生长,其结果与早先用过去试验过并获批准的培养基得到的结果相当。
抑制性试验,液体或固体培养基—将至少100cfu的适当微生物接种到适宜的培养基上。
在规定温度下培养,培养时间不少于试验规定的最长时间。
无微生物生长情况发生。
指征性试验—进行表面铺展法(见非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>下的平板计数法),用少量(不超过100cfu)适当微生物接种各平板。
在规定温度下培养,培养时间在试验规定的范围内。
其菌落在外观和指征反应中与过去那些用先前试验过并获批准的培养基得到的结果相当。
试验方法的适用性
按照产品检测中相关段落所述制备各新供试品样品。
混合时,在规定的生长培养基内加入各试验菌株。
分别接种试验菌株。
在接种的试验制备品中使用不超过100cfu的等量微生物。
表1.培养基的促生长,抑制性和指征性
Test/Medium
Property
TestStrains
Testforbile-tolerantCram-negativebacteria
EnterobacteriaEnrichmentBrothMossel
VioletRedBileGlucoseAgar
Growthpromoting
Inhibitory
Growthpromoting+Indicative
E.coli
P.aeruginosa
S.aureus
E.coli
P.aeruginosa
TestforEscherichiacoli
MacConkeyBroth
MacConkeyAgar
Growthpromoting
Inhibitory
Growthpromoting+Indicative
E.coli
S.aureus
E.coli
TestforSalmonella
RappaportVassiliadisSalmonellaEnrichmentBroth
XyloseLysineDeoxycholateAgar
Growthpromoting
Inhibitory
Growthpromoting+Indicative
Salmonellaentericassp.enlericaserotypetyphimurium
or
Salmonellaentericassp.entericaserotypeabony
S.aureus
Salmonellaentericassp.entericaserotypetyphimurium
or
Salmonellaentericassp.entericaserotypeabony
E.coli
TestforPseudomonasaeruginosa
CetrimideAgar
Growthpromoting
Inhibitory
P.aeruginosa
E.coli
TestforStaphylococcusaureus
MannitolSaltAgar
Growthpromoting+Indicative
Inhibitory
S.aureus
E.coli
TestforClostridia
ReinforcedMediumforClostridia
ColumbiaAgar
Growthpromoting
Growthpromoting
Cl.sporogenes
Cl.sporogein's
TestforCandidaalbicans
SabouraudDextroseBroth
SabouraudDextroseAgar
Growthpromoting
Growthpromoting+Indicative
C.alhicans
C.albicans
试验/培养基
特性
试验菌株
耐胆汁的革兰氏阴性菌试验
增菌肉汤培养基
紫红胆汁葡萄糖琼脂
促生长
抑制
促生长+指征
大肠杆菌
铜绿假单胞菌
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
铜绿假单胞菌
大肠杆菌试验
麦康凯肉汤
麦康凯琼脂
促生长
抑制
促生长+指征
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
沙门氏菌试验
氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤
木糖-赖氨酸去氧胆酸盐琼脂
促生长
抑制
促生长+指征
Salmonellaentericassp.
enlericaserotypetyphimurium
或
Salmonellaentericassp.
entericaserotypeabony
金黄色葡萄球菌
Salmonellaentericassp.
entericaserotypetyphimurium
或
Salmonellaentericassp.
entericaserotypeabony
大肠杆菌
铜绿假单胞菌试验
溴代十六烷基三甲铵琼脂
促生长
抑制
铜绿假单胞菌
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌试验
甘露醇食盐琼脂
促生长+指征
抑制
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
梭菌试验
梭菌增菌培养基
哥伦比亚琼脂
促生长
促生长
生芽孢梭状芽孢杆菌
生芽孢梭状芽孢杆菌
白色念珠菌试验
沙氏葡萄糖肉汤
沙氏葡萄糖琼脂
促生长
促生长+指征
白色念珠菌
白色念珠菌
按照产品检测中相关段落所述用规定的最短培养期进行试验。
必须用产品检测中所述的指征反应检出特定的微生物。
产品中任何的抑菌活性都有要求对试验规程进行修正(见非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>下的抑菌活性的中和/去除)。
对于给定产品,如果规定的有关微生物的抑菌活性不能中和,则假设产品中不存在此受抑制的微生物。
产品检测
耐胆汁革兰氏阴性细菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述将不少于1g的供试品1比10稀释制成样品,但是选择大豆-酪蛋白消化肉汤作为稀释剂,混合后在20°到25°培养充足的时间使其复苏,但不要使微生物繁殖(一般为2小时,但不超过5小时)。
不得检出的试验—除非另有规定,否则将在样品制备和预培养中制备的相当于1g产品的量,接种到肠道细菌浓缩肉汤液中。
在30°到35°培养24到48小时。
然后在紫红色胆汁葡萄糖琼脂上继续培养。
在30°到35°培养18到24小时。
如果无菌落生长,则产品符合试验。
定量试验—
选择和继续培养—将按样品制备和预培养中所述的制备品接种到适量肠道细菌浓缩肉汤液和/或分别含有0.1g,0.01g,和0.001g(或0.1mL,0.01mL,和0.001mL)供试品的稀释液中。
在30°到35°培养24到48小时。
在紫红色胆汁葡萄糖琼脂平板上继续培养。
30°到35°培养18到24小时。
判定—在菌落生长为阳性结果。
注意产品产生阳性结果的最小量和产生阴性结果的最大量。
根据表2确定细菌的可能数。
表2.结果解释
ResultsforEachQuantityofProduct
各产品量的结果
ProbableNumberofBacteria
pergormLofProduct
每g或每mL产品中细菌的可能数
0.1gor0.1mL
0.1g或0.1mL
0.01gor0.01mL
0.01g或0.01mL
0.001gor0.001mL
0.001g或0.001mL
+
+
+
−
+
+
−
−
+
−
−
−
morethan103
大于103
lessthan103andmorethan102
小于103并大于102
lessthan102andmorethan10
小于103并大于102
lessthan10
小于10
大肠杆菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述将不少于1g的供试品1比10稀释制成样品,并将10mL或与1g或1mL相当的量接种到适量(如试验方法的适应性所述确定)的大豆-酪蛋白消化肉汤上,混合后在30°到35°培养18到24小时。
选择和继续培养—震荡容器,将1mL大豆-酪蛋白消化肉汤转移到100mL的麦凯康肉汤上,并在42°到44°培养18到24小时。
在30°到35°,麦凯康琼脂平板上继续培养18到72小时。
判定—有菌落生长表明有可能存在大肠杆菌。
需要鉴别试验确定。
Theproductcomplieswiththetestifnocoloniesarepresentoriftheidentificationtestsarenegative.
如果无菌落存在或鉴定试验为阴性,则产品符合试验。
沙门氏菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述制备供试品,将与不超过10g或10mL相当的量接种到适量(如试验方法的适应性所述确定)的大豆-酪蛋白消化肉汤上,混合后在30°到35°培养18到24小时。
选择和继续培养—将0.1mL大豆-酪蛋白消化肉汤转移到10mL的氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤上,并在30°到35°培养18到24小时。
在木糖-赖氨酸去氧胆酸盐琼脂平板上继续培养。
在30°到35°培养18到48小时。
判定—在带或不带黑心的发育良好的红色菌落生长,表明有可能存在沙门氏菌。
要用鉴定试验确定。
如果描述的菌落类型不存在,或确证鉴定试验为阴性,则产品符合试验。
铜绿假单胞菌
30°to35°for18to24hours.
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述将不少于1g的供试品1比10稀释制成样品,并将10mL或与1g或1mL相当的量接种到适量(如试验方法的适应性所述确定)的大豆-酪蛋白消化肉汤上,并混合。
当检测透皮贴剂时,用无菌薄膜过滤器过滤相当于一贴制备品(见非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>下的透皮贴剂)的样品量,并放置在100mL的大豆-酪蛋白消化肉汤上。
在30°到35°培养18到24小时。
选择和继续培养—在溴代十六烷基三甲铵琼脂上继续培养,并在30°到35°培养18到72小时。
判定—有菌落生长说明可能存在铜绿假单胞菌。
要用鉴定试验确定。
如果菌落不存在,或确证鉴定试验为阴性,则产品符合试验。
金黄色葡萄球菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述将不少于1g的供试品1比10稀释制成样品,并将10mL或与1g或1mL相当的量接种到适量(如试验方法的适应性所述确定)的大豆-酪蛋白消化肉汤上,并混合均匀。
当检测透皮贴剂时,用无菌薄膜过滤器过滤相当于一贴制备品(见非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>下的透皮贴剂)的样品量,并放置在100mL的大豆-酪蛋白消化肉汤上。
在30°到35°培养18到24小时。
选择和继续培养—在甘露醇食盐琼脂平板上继续培养,并在30°到35°培养18到72小时。
判定—有黄色区带环绕的黄色或白色菌落生长说明有可能存在金黄色葡萄球菌。
要用鉴定试验确定。
如果描述的菌落类型不存在,或确证鉴定试验为阴性,则产品符合试验。
梭菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述制备供试品。
取两份相当于不超过1g或1mL的供试品。
一份在80°加热10分钟并迅速冷却。
另一份不加热。
选择和继续培养—从混合份中各取10mL转移到两个容器(38mmx200mm)或其它含有100mL梭菌补充培养基的容器中。
在缺氧条件下30°到35°培养48小时。
培养后,在哥伦比亚琼脂上继续培养各试管,并在缺氧条件下30°到35°培养48小时。
判定—有杆菌(带有或不带孢子)厌氧生长且过氧化氢酶反应为阴性,表明存在梭菌。
如果哥伦比来琼脂上没有检出微生物厌氧生长或过氧化氢酶试验为阳性,则产品符合试验。
白色念珠菌
样品制备和预培养—按照非无菌产品的微生物检查:
微生物计数试验<61>所述制备供试品,并将10mL或与1g或1mL相当的量接种到100mL的沙氏葡萄糖肉汤上,并混合。
在30°到35°培养3到5天。
选择和继续培养—在沙氏葡萄糖琼脂平板上继续培养,并在在30°到35°培养24到48小时。
判定—有白色菌落生长可能表明存在白色念珠菌。
这要鉴定试验确证。
如果无此类菌落存在或确证鉴定试验为阴性,则产品符合试验。
推荐溶液与培养基
[注意—给出本部分供信息参考。
]
下述溶液和培养基已经满足了药典中在微生物污染试验中其规定目的。
如果其它培养基有同样的促生长和抑制特性,也可以使用。
贮备缓冲液—将34g磷酸二氢钾移入1000mL容量瓶中,用500mL纯化水溶解,用氢氧化钠将pH调整到7.2±0.2,加入纯化水定容,并混合均匀。
装于容器内灭菌。
保存于2°到8°。
磷酸盐缓冲液pH7.2—制备一个纯化水和贮备缓冲液(800:
1v/v)的混合液,并灭菌。
BufferedSodiumChloride-PeptoneSolutionpH7.0
氯化钠蛋白胨缓冲液pH7.0
PotassiumDihydrogenPhosphate
磷酸二氢钾
3.6g
DisodiumHydrogenPhosphateDihydrate
磷酸氢二钠
7.2g(equivalentto0.067Mphosphate)
(相当于0.067M磷酸盐)
SodiumChloride
氯化钠
4.3g
Peptone(meatorcasein)
蛋白胨(肉或酪蛋白)
1.0g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
Sterilizeinanautoclaveusingavalidatedcycle.
用经过验证的周期在高压灭菌锅内灭菌。
Soybean-CaseinDigestBroth
大豆-酪蛋白消化肉汤
PancreaticDigestofCasein
酪蛋白胰酶消化物
17.0g
PapaicDigestofSoybean
大豆木瓜蛋白酶消化物
3.0g
SodiumChloride
氯化钠
5.0g
DibasicPotassiumPhosphate
磷酸氢二钾
2.5g
GlucoseMonohydrate
一水合葡萄糖
2.5g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
AdjustthepHsothataftersterilizationitis7.3±0.2at25°.Sterilizeinanautoclaveusingavalidatedcycle.
调节pH值,使其灭菌后在25°时的pH值为7.3±0.2。
用经过验证的周期在高压灭菌锅内灭菌。
Soybean-CaseinDigestAgar
大豆-酪蛋白消化琼脂
PancreaticDigestofCasein
酪蛋白胰酶消化物
15.0g
PapaicDigestofSoybean
大豆木瓜蛋白酶消化物
5.0g
SodiumChloride
氯化钠
5.0g
Agar
琼脂
15.0g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
AdjustthepHsothataftersterilizationitis7.3±0.2at25°.Sterilizeinanautoclaveusingavalidatedcycle.
调节pH值,使其灭菌后在25°时的pH值为7.3±0.2。
用经过验证的周期在高压灭菌锅内灭菌。
SabouraudDextroseAgar
沙氏葡萄糖琼脂
Dextrose
葡萄糖
40.0g
MixtureofPepticDigestofAnimalTissue
andPancreaticDigestofCasein(1:
1)
动物组织胃蛋白酶消化物与酪蛋白胰酶消化物混合物(1:
1)
10.0g
Agar
琼脂
15.0g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
AdjustthepHsothataftersterilizationitis5.6±0.2at25°.Sterilizeinanautoclaveusingavalidatedcycle.
调节pH值,使其灭菌后在25°时的pH值为5.6±0.2。
用经过验证的周期在高压灭菌锅内灭菌。
PotatoDextroseAgar
马铃薯葡萄糖琼脂
Infusionfrompotatoes
马铃薯浸出物
200g
Dextrose
葡萄糖
20.0g
Agar
琼脂
15.0g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
AdjustthepHsothataftersterilizationitis5.6±0.2at25°.Sterilizeinanautoclaveusingavalidatedcycle.
调节pH值,使其灭菌后在25°时的pH值为5.6±0.2。
用经过验证的周期在高压灭菌锅内灭菌。
SabouraudDextroseBroth
沙氏葡萄糖肉汤
Dextrose
葡萄糖
20.0g
MixtureofPepticDigestofAnimalTissueandPancreaticDigestofCasein(1:
1)
动物组织胃蛋白酶消化物与酪蛋白胰酶消化物混合物(1:
1)
10.0g
PurifiedWater
纯化水
1000mL
AdjustthepHsothataftersterilizationitis5.6±0.2at25°.Sterilizeinanautoclaveusin
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