PCR技术的原理与方法.docx
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PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法
PCR定义
PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理
一.PCR反应成分:
1.模板DNA;2.引物;3.四种脱氧核糖核苷酸;
4.DNA聚合酶;5.反应缓冲液、Mg2等。
二.PCR反应基本步骤:
1.变性:
高温使双链DNA解离形成单链(94℃,30s)。
2.退火:
低温下,引物与模板DNA互补区结合(55℃,30s)。
3.延伸:
中温延伸。
DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(70~72℃,30~60s)
1.变性(denaturation):
通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂,双链分开而成单链的过程。
2.退火(annealling):
当温度降低时,引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。
3.延伸(extension):
在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
以上述三个步骤为一个循环,每一循环的产物均可作为下一个循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n的形式增加。
•PCR扩增的基本方法
•PCR反应的成分和作用
总体积:
一般为25μl~100μl
(一)无Mg2buffer:
由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度,但不能超过50mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。
(二)Mg2:
终浓度为1.5~2.0mmol/L,其对应dNTP为200μmol/L,注意Mg2与dNTPs之间的
3.延伸:
延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内,一般在70~75℃。
延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定,通常对于1kb以内的片段1min是够用的。
循环数:
PCR的循环数主要由模板DNA的量决定,一般20~30次循环数较合适,过多的循环数会增加非特异扩增产物,具体要多少循环数可通过预试验确定。
PCR产物积累规律:
反应初期产物以2n呈指数形式增加,至一定的循环数后,引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡,产物进入一个缓慢增长时期(“停滞效应”),即“平台期”。
到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。
•PCR扩增仪
PCR常见问题
一.没有扩增产物
1.循环温度:
变性温度、退火温度
2.引物设计
3.DNA聚合酶活性
4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)
5、DNA样品
二.非特异产物及电泳呈涂布状
1.Mg2浓度
2.调整引物、模板、聚合酶的用量
3.适当减少循环数
4.适当提高退火温度,缩短退火或延伸时间
•三.引物二聚体的形成
1.检查引物的序列
2.提高退火温度
3.调整引物与模板浓度
4.增加引物长度
•四.假阳性结果的预防
1、实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)
2、注意操作环境,戴一次性手套
3、严格PCR操作规程
4、多次取样的试剂应分装
5、设置阴性对照和阳性对照
PCR相关技术
一.锚定PCR(anchoredPCR):
•引进锚定引物,可以帮助克服序列未知或序列未全知的障碍。
•在DNA3’-末端加上poly(dG)尾,与此相对应的锚定引物poly(dC)一般应在十二聚以上。
二.不对称PCR(asymmetricPCR)
不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度,两条引物浓度比为1:
50或1:
100,前12个循环两条模板等量扩增,之后低浓度引物消耗殆尽,其扩增产物减少以至于无;而高浓度引物介导产生的扩增产物(即单链DNA)逐渐增加,可得到大量单链DNA(ssDNA)用于直接测序。
三.反向PCR(inversePCR)
四.多重PCR(multiplexPCR)
多重PCR是用多对引物同时对模板DNA上的多个区域进行扩增。
多重PCR技术的难点不是在于其原理和操作的复杂性,而是在于其多对引物的设计,必需保证多对引物之间不形成引物二聚体,引物与目标模板区域具有高度特异性。
应用于基因诊断,对与疾病相关的基因(庞大)进行扩增检测。
五.逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)
•由mRNA逆转录产生cDNA链作为PCR反应模板。
•逆转录合成cDNA时,引物可选用特异引物、随机六聚体引物或寡聚dT(12-18)。
•设计RT-PCR的引物时最好是分散在不同的外显子上,以免基因组DNA的污染导致假阳性结果
六.差别PCR(differentialPCR)
差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中,用同一套引物进行扩增,电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。
七.原位PCR(InsituPCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR,对细胞中的靶DNA进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。
可分为直接法和间接法。
基本步骤:
组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测
优点:
灵敏度高,可进行细胞内定位
八.荧光定量PCR(FQ-PCR)
荧光定量PCR:
融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团),结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。
主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针,PCR过程中,具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时,将DNA探针逐个降解,释放出荧光报告基团,这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。
•荧光定量PCR的优点:
•1.可进行准确的定量检测。
用于基因诊断。
•2.定量范围宽。
•3.特异性更强,克服了假阳性。
•4.操作简单快速,无须后处理和电泳检测。
•5.安全,技术易于学习,易于进行电脑化数据管理。
PCR技术的应用
1.遗传性疾病的基因诊断
2.传染病的诊断(肝炎病毒)
3.癌基因检测
4.法医学(亲子鉴定)上的应用
5.DNA测序
6.基因克隆
7.引入基因点突变,基因融合等
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