Ion Matepair文库构建方法.docx
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Ion Matepair文库构建方法.docx
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IonMatepair文库构建方法
IonMate-pair文库构建手册
一、流程图
基因组DNA提取
↓
基因组定量检测
↓
DNA破碎(CovarisS2)
↓
末端修复
↓
文库片段选择(凝胶电泳,SOLiD凝胶回收试剂盒纯化)
↓
文库片段定量
↓
MP接头连接(SOLiDMP接头连接试剂盒)
↓纯化
Qubit定量
↓
确定DNA回收量,确定回收到的片段含量(根据DNA含量确定是否可进行下一步)
↓
DNA片段环化
↓
纯化环状DNA(除去非环化DNA)
↓纯化
定量(若起始上样量为1-2ug,则不需要定量)
↓
环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化
↓
T7核酸外切酶、S1核酸酶酶切
↓磁珠纯化
末端修复
↓
文库片段于链霉素亲和素微珠相连
↓
连接Ion接头
↓
缺口修复、预扩增凝胶条带检测(确定循环数)
↓
片段扩增(使用确定的循环数扩增)
↓SOLiD试剂盒纯化
E-Gel胶回收
↓
Agilent检测,Qubit定量
↓
文库构建完成
二、实验步骤:
第一部分:
样品打断及定量
1.样品质控
OD260/280=1.8-2.0
使用1-5uggDNA起始
2.DNA片段化处理
使用0.2mlPCR管,使用LowTE将1ugDNA稀释到200ul,装入0.2的PCR小管中。
按照以下条件将DNA打断成3kb大小的片段:
TargetBP
3kb
Intensity
0.1
DutyCycle
20%
CyclesperBurst
1000
TreatmentTime(s)
600
Temperature(℃)
20
SampleVolume(ul)
200
3.末端修复
使用Mate-PairedLibraryEnzymeModule
按照以下条件配置体系:
Compoent
3-kblibrary
ShearedDNA
<67uL
5×ReactionBuffer
20.0uL
10mMdNTP
4.0uL
EndPolishingE1
4.0uL
EndpolishingE2
5.0uL
Nuclease-freeWater
Vareis
Total
100uL
室温(20-25℃)下放置30min。
将以下体系加入到上述反应体系中:
Component
3-kblibrary
20%SDS
8.5uL
10×BlueJuiceGelLoadingBuffer
10.0uL
65℃变性处理10min,冰上放置5min后,准备琼脂糖凝胶分离和切胶回收
4.琼脂糖凝胶电泳及切胶回收
准备1%琼脂糖凝胶分离3-kb片段
配置琼脂糖胶
Component
Volume
1×TAE
20.0mL
Agarose
0.2g
Du-red稀释液
20uL
Total
20mL
使用大孔梳子做成一块分离胶,待胶凝固之后放入电泳槽中,点入Marker和样,120V,80mA电泳20-30min,使用胶回收试剂盒进行切角纯化。
5.样品定量
使用Qubit2.0对纯化后的DNA片段进行定量。
——StoppingPoint——
第二部分:
环化
1.计算MP接头加入量:
公式:
需要加入MP接头的量(uL)Y
配置以下体系:
Component
Volume
End-repairedDNA
<60uL
5×ReactionBuffer
20.0uL
MPRAdaptor(ds),25uM
YuL
MPLAdaptor(ds),25uM
YuL
T4DNALigase,5U/uL
10.0uL
Nuclease-freeWater
VariableuL
Total
100uL
室温(20-25℃)下放置30min。
2.磁珠纯化
1)准备体系
Component
Volume
Samplereaction
100uL
Nuclease-freeWater
150uL
AgencourtAMPure®XPReagent
200uL
Total
450uL
a.震荡混匀15s后,瞬时离心
b.室温下(20-25℃)放置5min
c.将LoBind离心管放置到磁力架上至少1min,待溶液澄清后,除去上清液
2)保持离心管在磁力架上,使用新配置的70%乙醇洗涤2遍
a.向离心管内加入600uL新配的70%乙醇
b.保持离心管在磁力架上1min,小心除去上清
3)取下离心管,瞬时离心后,将离心管放回磁力架,待溶液澄清后,使用20uL枪头除去剩余的乙醇
4)打开离心管,室温下干燥3min,除去多余的乙醇
5)洗脱
a.将离心管从磁力架上取下,向管内加入50uLElutionBuffer(E1)
b.漩涡混匀15s,瞬时离心,室温下放置3min
c.将离心管放回到磁力架上至少1min,至溶液变得澄清
d.将上清液放置到一支新的1.5mLLoBind离心管
3.Qubit定量
使用Qubit2.0对回收的DNA片段进行定量
回收片段/始上样量
处理
>5%
进行环化处理
<5%
可进行环化处理,但后续的纯化步骤需保证回收量
≤50ng
重新进行文库构建
——StoppingPoint——
4.环化DNA
分子内杂交形成环状DNA分子
处理:
1)计算体积处理
公式:
DNA体积VDNA=50uL,DNA浓度=xng/mol,T=100xuL
Component
Volume
DNA
VuL
10×Plasmid-Safe™Buffer
T/10uL
Nuclease-freeWater
T-(T/10)-VuL
Total
TuL
混合产物放置到PCR仪上,70℃处理5min,然后迅速放置到冰上5min
2)环状DNA分离
使用Plasmid-Safe™DNase除去未环化DNA。
处理过后,使用磁珠纯化
Plasmid-Safe™DNase处理
Component
Volume
CircularizedDNA
T*uL
ATP100mM
T/100uL
Plasmid-Safe™DNase,10U/ul
T/100uL
*T=环化DNA反应体系的总体积
37℃处理40min
磁珠纯化
1)配置体系:
Component
Volume
Samplereaction
TuL
BeadDilutionBuffer
0.7×TuL
AgencourtAMPure®XPReagent
0.3×TuL
a.漩涡震荡15s,瞬时离心
b.室温下(20-25℃)放置5min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清,除去上清液
2)洗涤DNA2次,使用新配制的70%乙醇
a.加入600uL70%乙醇到离心管中
b.保持离心管在磁力架上至少1min,除去上清
3)将离心管从磁力架上取下,瞬时离心后,放回磁力架。
使用20uL枪头除去多余的乙醇
4)打开盖子,室温下干燥3min
5)混合
Component
Volume
Nuclease-freeWater
84uL
NickTranslationBuffer
10.0uL
6)洗脱DNA
a.将离心管从磁力架上取下,加入91uL上述混合液
b.轻轻涡旋离心15s,室温下放置3min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液变得澄清
d.将上清液转移到一支新的0.2mL离心管中
5.缺口修复与纯化
缺口修复
注意:
该步骤保温过程在PCR仪上进行时,需将热盖关闭,否则会对酶造成破坏,在混合之前,分别将酶和反应体系放置到5℃上数分钟
1)向一支0.2PCR管中放入:
Component
Volume
DNAse-treated,purifiedDNA
90uL
10mMdNTP
5.0uL
2)漩涡混匀,离心
3)将离心管放置到PCR仪中,5℃保持2-3min,关闭热盖!
4)取出另一支0.2mL离心管,加入5uLDNA聚合酶Ⅰ,瞬时离心
5)将装有DNA聚合酶Ⅰ的离心管放入PCR仪中,5℃大于1min,关闭热盖
6)设置计时器10min
7)将装有混合反应液的体系加入到装有DNA聚合酶Ⅰ的离心管中,上下吹打5次混匀,放回到PCR仪,关闭热盖
8)开始计时10min
9)将400ulBindingBuffer(B2-S)和异丙醇(55%)装入一支1.5mLLoBind离心管中
10)在孵育的最后阶段,迅速将反应体系加入到上述的混合液中,终止反应
片段纯化
使用SOLiDLibraryMicroColumnPurificationKit
1)将空的PureLinkMicro离心柱10000g离心1min,确定离心柱膜没有鼓起或折叠
2)将DNA加入到分离柱中
a.将nick-translatedDNA和BindingBuffer充分混匀
b.将混合液装入到柱子内
c.室温下10000g离心1min,弃去液体,此时DNA在离心柱膜上
3)洗涤柱子
a.将分离柱放回到收集管内
b.加入650ul混有乙醇的WashBuffer(W1)
c.室温下10000g离心1min,弃去液体
d.室温下14000g离心1min,除去多余的乙醇
4)洗脱DNA
a.将分离柱放入到一直新的1.5mL离心管中
b.加入25ulElutionBuffer(E1)于收集管膜的中央,保持离心管竖直1min
c.室温下14000g离心1min
d.将离心液体放回离心柱中,保持离心柱竖直1min
e.室温下14000g离心1min
离心出来的溶液即纯化的DNA产物
——StoppingPoint——
第三部分酶切
1.双酶切
T7核酸外切酶:
本酶作用于双链DNA,沿5’→3’方向除去5’单核苷酸,既能从5’末端起始消化,又能从双链DNA切口或缺口处消化,既能降解5’磷酸化DNA,又能降解5’去磷酸化DNA
S1核酸酶:
是一种高度单链特异性的核酸内切酶,在最适的酶催化反应条件下,降解单链DNA或RNA,产生待5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸,对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体不敏感
T7核酸外切酶处理
1)体系:
Component
Amount
DNA
25ul
10×Buffer4
5.0ul
T7Exonuclease
2.0ul
Nuclease-freeWater
18.0ul
Total
50ul
2)反应体系37℃孵育15min
3)70℃热处理20min
4)冰上放置5min
S1核酸酶处理
1)使用S1核酸酶稀释Buffer将1ulS1核酸酶稀释至50U/ul
2)体系
Component
Amount
DNA
50ul
3MNaCl
1.7ul
S1Nuclease
2.0ul
Total
53.7ul
3)37℃孵育45min
纯化
使用AgencourtAMPure®XPReagent磁珠纯化
1)将磁珠充分混匀
2)按照以下体系配置混合液
Component
Volumn
SampleReaction
53ul
AgencourtAMPure®XPReagent
95ul
Total
148ul
a.漩涡混匀15s,瞬时离心
b.室温下放置5min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min,至溶液澄清,除去上清液
3)洗涤2次,保持离心管在磁力架上
a.加入600ul新配置的70%乙醇
b.保持离心管在磁力架上至少1min,除去上清
4)将离心管从磁力架山取下,瞬时离心后将离心管放回磁力架,使用20ul枪头小心除去多余的乙醇
5)打开离心管盖,室温下干燥3min
6)洗脱DNA
a.将离心管从磁力架上取下,向管中加入50uLElutionBuffer(E1)
b.漩涡震荡15s,瞬时离心,室温下放置大于3min
c.将离心管放回磁力架上至少1min,至溶液澄清
d.将上清转移到一直新的1.5mL离心管中
——StoppingPoint——
2.末端修复
1)准备末端修复体系
注意:
使用EndpolishingEnzyme2
Component
Volume
T7/S1-digestedDNA
50ul
5×ReactionBuffer
20.0ul
10mMdNTPMix
2.0ul
EndPolishingEnzyme2
2.0ul
Nuclease-freeWater
26ul
Total
100ul
2)室温下孵化30min
注意:
孵化过程中可先做链霉素磁珠的预洗步骤
3)向体系中加入5.0ul0.5MEDTA终止反应
4)准备以下体系
Component
Volume
StoppedEnd-repairBuffer
105ul
BeadsBindingBuffer
200ul
Nuclease-freeWater
95ul
Total
400ul
3.与链霉素磁珠相连
1)预洗磁珠
准备1×BSA缓冲液
Component
Volume
100×BSA
5.0ul
Nuclease-freeWater
495uL
Total
500ul
2)将装有链霉素磁珠的离心管漩涡混匀,取出50ul到一支新的1.5mLLoBind离心管
3)将500uLBeadsWashingBuffer加入到50ul磁珠中,漩涡震荡15s,瞬时离心
4)将离心管放置到磁力架上至少1min,至溶液澄清,除去上清液
5)加入500ul1×BSA,漩涡混匀15s,瞬时离心
6)将离心管放回磁力架至少1min,溶液澄清后,除去上清液
7)加入500ulBeadBindingBuffer,漩涡震荡15s,瞬时离心
注意:
当DNA末端修复结束后再进行步骤8
8)将离心管放回磁力架至少1min,待溶液澄清后除去上清液
DNA与磁珠连接:
1)将400uLDNA末端修复产物加入到磁珠中,瞬时离心
2)使混合液在室温下旋转震荡30min,瞬时离心
洗涤复合物
1)准备1×ReactionBuffer
Component
Volume
5×ReactionBuffer
120ul
Nuclease-freeBuffer
480ul
Total
600ul
2)将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清,除去上清
3)洗涤磁珠三次
a.加入500ulBeadWashBuffer,漩涡震荡15s,瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min,至溶液澄清,除去上清液
4)洗涤及重新悬浮DNA
a.使用500ul1×ReactionBuffer重新悬浮DNA,漩涡震荡15s,瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min,至溶液澄清,除去上清
c.加入87ul1×ReactionBuffer再悬浮
第四部分Ion文库步骤
1.连接Ion接头
1)加接头
a.配制以下体系
Component
Volume
DNA-Beadcomplex
87ul
IonLibraryAdaptorMix+
3.0ul
T4DNALigase,5U/ul
10.0ul
Total
100ul
+AdaptorMix配方见附加部分
b.室温下旋转混合反应体系30min
c.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清,除去上清液
2)洗涤DNA磁珠三次
a.加入500uLBeadsWashBuffer再悬浮,漩涡震荡15s,瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清,除去上清
3)洗涤及再悬浮DNA磁珠复合体
a.加入500ulElutionBuffer(E1)再悬浮DNA,漩涡震荡15s,瞬时离心
b.将离心管放置到磁力架上至少1min至溶液澄清,除去上清
c.加入30ulElutionBuffer(E1)使DNA再悬浮
——StoppingPoint——
2.缺口修补及文库预扩增
预扩增
1)配制如下体系
Component
Volume
PlatinumPCRAmplificationMix
70ul
IonLibraryAmplificationMix
2.5ul
Total
72.5ul
2)将体系旋窝混合,瞬时离心,对照管向其中加入23μLPCR反应体系混合液,标号“PCR#0”
3)将4.0μLDNA-磁珠复合物加入到49.8μLPCR反应混合体系反应液中,旋窝震荡混匀,然后分为2管(约25μL),标号PCR1#、PCR2#
4)使用两个不同的PCR仪按照下面的循环数运行
Sampleno.
Numbersofcycles
3-kblibrary
0
16cycles
1
12cycles
2
16cycles
5)运行
时期
步骤
温度
时间
Holding
缺口修复
72℃
20min
Holding
变性
94℃
5min
Cycling
变性
94℃
15s
退火
58℃
15s
延伸
68℃
1min
Holding
-
4℃
∞
6)电泳结束后,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,确定适宜的循环数
缺口修补及文库扩增
1)准备反应体系
Component
Volume
PlatinumPCRAmplificationMix
200ul
IonLibraryAmplificationPrimerMix
10.0ul
Total
210ul
2)将离心管放置到磁力架上至少1min,至溶液澄清
3)使用20uL枪头,小心除去上清,留下5-10uLElutionBuffer于体系中,不可将磁珠吸入到枪头中
4)将第一步中的PCR扩增体系加入到DNA-磁珠复合体的离心管中
5)旋窝震荡15s,瞬时离心,将混合液分装到两个新的PCR管中
6)PCR扩增
时期
步骤
温度
时间
Holding
缺口修复
72℃
20min
Holding
变性
94℃
5min
Cycling(根据预扩增确定的循环数)
变性
94℃
15s
退火
58℃
15s
延伸
68℃
1min
Holding
-
4℃
∞
使用SOLiD纯化柱对文库进行纯化
1)将装有PureLinkMicroColumn的离心管放入到离心机中,10000g/min预离心1min
2)加入4倍体积混有异丙醇的BindingBuffer(B2-L)于1体积的样品中,充分混匀,将PCR扩增样品混合。
3)将DNA加入到PureLinkMicro纯化柱
a.确定所有PCR扩增产物都被完全收集到一支离心管中
b.10000r/min室温下离心1min,弃去液体,DNA在纯化柱中
c.确定所有的PCR产物都加入到了纯化柱中
4)洗涤柱子
a.将纯化柱放回到原来的离心管中
b.加入650μL含有乙醇的WashBuffer(W1)于纯化柱中
c.室温下10000g/min离心1min,弃去液体
d.14000g/min离心,除去多余的洗脱液
5)洗脱DNA
a.将纯化柱转移到一支新的1.5mL离心管
b.加入25μLElutionBuffer(E1)于纯化柱正中间,保持纯化柱竖直1min
c.14000g/min,室温下离心1min
d.加离心管内的洗脱液再次加入到纯化柱中,保持纯化柱竖直1min
e.室温下14000r/min离心1min
——StoppingPoint——
E-gel凝胶回收
使用E-gelSizeSelect2%gel进行条带回收
附加部分:
AdaptorMix配制方法
1.准备材料
PCR仪
移液枪
5×T4DNA连接酶
SOLiDBufferKit——1×LowTEBuffer
Oligonucleotides,HPLCpurified
PCRstriptubes
Filteredpipettortips
2.准备IonLibraryAdaptorMix(P1-A)
1)在将Ion文库接头和DNA连接之前,根据以下步骤制备寡核苷酸。
寡核苷酸探针与单链寡核苷酸杂交形成双链寡核苷酸。
Adaptor
OligoName
Sequence
Length
A_TT
T_ad_A_TT
5-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3'
30
A_TT
T_ad_A_TT_comp
5-CTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG*T*T-3'
32
P1
P1a
5-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'
41
P1
P1b
5-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGG*T*T-3'
43
2)使用1×LowTE缓冲液将每管寡核苷酸稀释至200uM
3)将相同体积的200uM“T_ad_A_TT”和“T_ad_A_TT_comp”寡核苷酸于5×T4DNA连接酶Buffer混合,最终使1×连接Buffer中包含40uM寡核苷酸。
例如:
需要配置100uLIonAdaptorA
Component
Amount
200μMT_ad_A_TT
20.0ul
200μMT-ad_A_TT_comp
20.0ul
5✕T4DNALigaseBuffer
20.0ul
Nuclease-freeWater
40ul
Total
100ul
4)在另一支离心管中,加入相同体积的200uM“P1a”和“P1b”寡核苷酸于5×T4DNA连接酶Buffer混合,最终使1×连接Buffer中包含40uM寡核苷酸。
例如:
需要配置100uLIonP1Adaptor
C
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- Ion Matepair文库构建方法 Matepair 文库 构建 方法