RTPCR实验报告课件.docx
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RTPCR实验报告课件
逆转录
pcr
rt-pcr
)和及时
为反转录rcr(reversetranscriptionpcr
pcr(realtimepcr)共同的缩写。
逆转录
pcr
,或许称反转录
pcr(reverse
transcription-pcr,rt-pcr),是聚合酶链式反响(pcr)中,一条rna链被逆转录成为互补dna,再以此为模板经过
的一种宽泛应用的变形。
在
pcr进行dna扩增。
rt-pcr
由一条
rna
单链转录为互补
dna(cdna)
称作“逆转录”,由依靠
rna
的
dna
聚合酶(逆转
录酶)来达成。
随后,
dna
的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠
rna
的
dna
聚合酶达成,
随每个循环倍增,即往常的pcr。
原来的
rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术,
于遗传病的诊疗,并且能够用于定量监测某种
rna
模板被rna酶h降解,留下互补dna。
能够检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr宽泛应用
rna的含量。
(检测基因表达的方法,拜见
northernblot
法。
)
rt-pcr
作“定量
有时也会指代及时
pcr”(quantitativepcr)
pcr(real-timepcr)。
为了与逆转录
或许rtq-pcr(real-timequantitativepcr)
pcr
相差别,往常被写
。
及时
pcr
及时
为基础进行
pcr(real-timepcr)
dna的定量剖析。
,属于定量pcr
realtimepcr
(q-pcr)的一种,以一准时间内dna的增幅量
的定量使用萤光色素,当前有二种方法。
一种是在
dsdna
中插入特异的萤光色素;
另一种使用一种能与增幅
dna
序列中特定寡核酸序
列相联合的一种萤光探针(
probe
)。
real
time
pcr
与
reverse
transcription
pcr
相
联合,能用微量的
rna
来找出特准时间、
细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种
rt
pcr
的组合又被称之为“定量
rt-pcr
(
quantitativert-pcr
)”
rt-pcr
技术有关试剂
oligo:
多聚体,相当于
mrna
引物
amv
dntp
rnase
(m-mlv):
逆转录酶
:
脱氧核苷酸
:
rna酶克制剂
pcrbuffer
:
rt-pcr
缓冲液
mgcl2
pcr
:
2价镁离子
各步骤的目的
(一)预变性:
损坏
dna
中可能存在的较难损坏的二级构造。
使
dna
充分变性,减少
dna
复杂构造对
扩增的影响,以利于引物更好的和模板联合,特别是对于基因组根源的
dna
模板,最好不要
吝
啬这个步骤。
别的,在一些使用热启动taq酶的反响中,还可激活taq酶,进而使pcr
反响得以顺利进行。
(二)变性--退火--延长循环:
①模板dna的变性:
模板dna经加热至93℃左右一准时间后,使模板dna双链或经pcr
扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物联合,为下轮反响作准备;
②模板dna与引物的退火(复性):
模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,
引物与模板dna单链的互补序列配对联合;
③引物的延长:
dna模板--引物联合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反响原料,
靶序列为模板,按碱基配对与半保存复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保存复
制链。
(三)pcr仪扩增循环后72度延长10分钟
用pcr仪扩增时,(变性.退火,延长)循环达成后,持续72度延长了10分钟的原由:
1.
延长时间取决于待扩增
dna片段的长度。
(自然是在反响系统必定的条件下)
比如,使
用taqdna聚合酶,72度时的碱基掺入率为
35-100bp/s
,所以延长速率为
1kb/min
。
2.
依据延长速率推得,扩增
1kb之内的
dna片段
1min即可,而3-4kb
则需要
3-4min,
挨次照推。
往常在最后一轮要适合的将
延长时间延长至4-10min,这样做是使pcr反响完好以提升扩增产量。
3.持续72度延长了10分钟除了能够使pcr反响完好以提升扩增产量外,还有一个作用
是:
在用一般taq酶进行pcr扩增时在产物尾端加a尾的作用,能够直接用于ta克隆的进行。
什么是半定量pcr
半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitativereversetranscriptionand
polymerasechainreaction,sqrt-pcr)是最近几年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方
法,经过mrna反转录成cdna,再进行pcr扩增,并测定pcr产物的数目,能够推断样品中
特异
mrna
的相对数目。
以半定量
rt-pcr
为基础成立起来的
mrna
含量测定技术,
较含内标化
的
rt-pcr
定量测定的
mrna
的方法更为简易可行。
这类方法不另设‘内标准
清除了俩对不
同引物之间的相互克制和敏捷读差别,并且拥有显然的剂量-效益关系和优秀的重复性。
步
骤:
1.抽提rna,2.反转录获取cdna,3.以cdna为模板做pcr注意:
步骤1,
rna抽提质量必定要好,注意污染。
内参的选择,常用的有βactin和gapdh俩中。
步骤
3,半定量
rt-pcr
应当再两管中进行,既内参和目的基因各一管,这样便于控制,做图的时
候能够放在一各泳道里跑!
指数期和平台期必定要摸清楚!
半定量rt-pcr与荧光定量real-timepcr最大的差别就在于semi-pcr需要跑电泳根
据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或许是表达量的高低而real-timepcr则无需
电泳能够及时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standardcurve来判断gene拷贝
数的高低。
所以由上可见semi-pcr不如real-timepcr精准。
至于rt应当指reversetranscription。
为了便于划分我们更偏好使用qpcr来特指real-timepcr
同时要注意realtime-pcr的定性问题,有时你扩增出来的很有可能不过引物二聚体。
所以要利用meltingcurve,假如是第一次做一个目的基因的realtime-pcr,仍是要在2%的
琼脂糖凝胶中进行电泳,以确立与你要扩增的目的基因大小一致。
rt-pcr只好经过模板pcr后扩增的结果间接的反响初始模板的量。
而realtime-pcr的
结果直接能够看到初始模板的量。
所以,
realitime-pcr
更精准些。
篇二:
rt-pcr
实验方法
逆转录pcr(rt-pcr)
实验四逆转录
pcr
(rt-pcr)
【实验目的】
1.认识用逆转录
pcr
法获取目的基因的原理。
2.学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反响(pcr)过程利用模板
变性,引物退火和引物延长的多个循环来扩增dna序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一
轮扩增的模板,是一个指数增
实验四
逆转录
pcr(rt-pcr)
【实验目的】
1.认识用逆转录
2.学习和掌握逆转录
pcr
法获取目的基因的原理。
pcr的技术和方法。
【实验原理】
rt-pcr技术敏捷并且用途宽泛,
病毒的含量和直接克隆特定基因的
可用于检测细胞中基因表达水平、
cdna序列。
rt-pcr比其余包含
表达差别,细胞中
northern印迹、rnase
rna
保
护剖析、原位杂交及
s1
核酸酶剖析在内的
rna
剖析技术,更敏捷,更易于操作。
rt-pcr
的基根源理(图
4.1)。
第一是在逆转录酶的作用下从
rna
合成
cdna
,即总
rna
中的
mrna
在体外被反向转录合成
dna
拷贝,因拷贝
dna
的核苷酸序列完好互补于模板
mrna
,
称之为互补
dna(
cdna
);而后再利用
dna
聚合酶,以
cdna
第一链为模板,以四种脱氧核苷
三磷酸(
dntp
)为资料,在引物的指引下复制出大批的
cdna
或目的片段。
在
rt
时,有
3
种引物可选择
(表
4.1)
。
用
1)和
2)方法,
先
理论上是扩增的所有的
cdna
,还要用此产物做
要
pcr
的模板持续扩增。
假如用
3)方法,
去
/retype/zoom/7b17bdaf89eb172ded63b7a3?
pn=2&x=0&y=1268&raww=535&rawh=340&o=png_6_
0_0_135_265_601_383_892.979_1262.879&type=pic&aimh=305.04672897196264&md5sum=388
ad1889e15cfe390decc00721a2ce0&sign=8ccc656492&zoom=&png=48793-106221&jpg=0-0"
target="_blank">
由图4.1
点此查察
不难看出,随机引物法是三种方法中特异性最低的。
引物在整个转录本的多个
位点退火,产生短的,部分长度的
cdna。
这类方法常常用于获取
5尾端序列及从带有二级结
构地区或带有逆转录酶不可以复制的停止位点的
rna
模板获取
cdna
。
为了获取最长的
cdna,需
要按经验确立每个
每20μl反响系统。
rna样品中引物与rna因为使用随机引物从总
的比率。
随机引物的开端浓度范围为
rna合成的cdna主假如核糖体
rna
50到250ng
,所以模板一
般采纳
poly(a)+rna
。
oligo(dt)
尾杂交。
因为
开端比随机引物特异性高。
它同大多半真核细胞mrna3端所发现的
poly(a)+rna大体占总rna的1%到2%,所以与使用随机引物对比,
poly(a)
cdna的数
量和复杂度要少得多。
因为其较高的特异性,
oligo(dt)
一般不需要对
rna
和引物的比率及
poly(a)+选择进行优化。
建议每
合用于多半rt-pcr。
20μl
反响系统使用
0.5μgoligo(dt)
。
oligo(dt)12-18
基因特异性引物(
gsp)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。
gsp
是反义寡聚核苷,可
以特异性地同
rna
目的序列杂交,而不象随机引物或
oligo(dt)
那样同所有
rna
退火。
用于
设计
pcr
引物的规则相同合用于逆转录反响
gsp
的设计。
gsp
能够同与
mrna3
最尾端退火的
扩增引物序列相同,或
gsp
能够设计为与反向扩增引物的下游退火。
已经制备好的双链
cdna
和一般
dna
相同,能够插入到质粒或噬菌体中,
为此,第一必需
有适合的接头
(linker)
,接头能够是在
pcr
引物上增添限制性内切酶辨别位点片段,经
pcr
扩增后再克隆入相应的载体;
也能够利用尾端转移酶在载体和双链
cdna
的尾端接上一段
寡聚
dg
和
dc
或
dt
和
da
尾巴,
退火后形成重组质粒
并转变到宿主菌中进行扩增。
本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因,fas配体(fasl)是一分子量约为40u
的ii型跨膜糖蛋白,属tnf家族成员。
活化的t细胞可表达fas和fasl,并经过fas/fasl
系统介导细胞凋亡作用,保持机体免疫系统的自稳态。
最近几年研究发此刻部分癌细胞中fasl
表达加强,并与肿瘤的复发转移有关。
我们采纳rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并建立其表
达载体,能够为进一步研究fasl的功能供给条件。
在上下游引物的5’端分别加上了限制酶
切位点及其保护碱基(即hindiii和bamhi),以便能够经过双酶切将目的片段定向的克隆
到原核表达载体pgfpuv上(附录图4.3)。
为了便于后续实验能够用金属螯和层析的方法分别和纯化目的蛋白,我们改造了pgfpuv
在其上加了6×his标签。
【试剂与器材】
(一)试剂
,
1.总rna(或mrna)
2.rna
酶克制蛋白(
rnaseinhibitor
):
40u/ml
3.dntp
混淆物
(
各
10mm)
4.oligo(dt)12-18
:
2.5?
mol/l
5.10*逆转录合成缓冲液(10?
rtbuffer):
250mmol/ltris-hcl(ph8.3),375mmol/l
kcl,15mmol/lmgcl2
6.amv
逆转录酶
5u/?
l
7.基因特异性
5’和
3’引物各
20?
mol/l
8.tapdna
聚合酶
5u/?
l
9.10*pcr
缓冲液:
500mmol/l
kcl
,100mmol/l
tris?
cl
,在
25℃下,ph9.0
,1.0%triton
x-100
,15mmol/lmgcl2
。
(二)器材
1)pcr仪,
2)pcr管,
3)微量移液器【操作方法】
(一)逆转录:
1)成立rt反响系统:
2)涡旋混匀,42℃反响1小时,95℃加热5分钟,而后置于冰上。
(二)pcr扩增:
1)成立pcr反响系统:
2)将上述反响系统涡旋混匀,按以下程序运转循环:
step2-4运转30个循环,此中复性温度主要依照引物的不同而不同。
(三)取10-20ulpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,余下的
pcr
产物-20
℃保存。
【注意事项与提示】
1.逆转录反响过程,需成立无rnaase
2.成功的逆转录反响决定于高质量的模板
逆转录酶的克制剂,如edta或sds。
别的,
基因组dna。
使用较好的rna分别方法,如
环境,以防止rna的降解。
rna。
高质量的rna起码应保证全长并且不含
rt-pcr所碰到的一个潜伏的困难是rna中沾染的
trizolreagent,会减少rna制备物中沾染篇三:
rt-pcr
rt-pcr
rt-pcr
实验方法总结
实验方法总结
实验有三步:
抽提
rna,rt
,pcr
。
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录系统对rna量仍是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按惯例。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完好的cdna存在,不
是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计能否是必定要先知道目的基因的序列?
一定
在rt时,引物设计有3种方法即a:
random9mers;b:
oligodt-adaptorprimer;和
c:
特异的下游引物。
假如用a和b方法,是扩增的所有的cdna(理论上),还要用此产物做
pcr
的模板持续扩增。
如果用c
方法,那
么
要去那
里
查它
的序
列呢?
/retype/zoom/e0c5d6ebaeaad1f346933f1e?
pn=5&x=0&y=474&raww=16&rawh=16&o=png_6_0_0
_438_601_18_18_893.25_1263.375&type=pic&aimh=16&md5sum=86a939f122dd0d749a911550d
24d3d30&sign=a7f1328b61&zoom=&png=2074-8806&jpg=0-0"target="_blank">点此查察
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
pcr试剂pcr比较特异性
pcr
试剂盒
pcr
克隆试剂盒
rna
rnase
检测/
去除
rt-pcr试剂rt-pcr标准品定量pcr试剂定量
产物纯化核酸酶聚合酶反转录酶rt-pcr实验方法大全
公布日期:
2007-7-10热点指数:
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rt-pcr实验有三步:
抽提rna,rt,pcr。
pcr
标记
总
rna
分别纯化盒
pcr
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录系统对rna量仍是有一些要求,常用500ng或1ug。
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按惯例。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完好的cdna存在,不
是单改变mg2浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计能否是必定要先知道目的基因的序列?
一定
在rt时,引物设计有3种方法即a:
random9mers;b:
oligodt-adaptorprimer;和
c:
特异的下游引物。
假如用a和b方法,是扩增的所有的cdna(理论上),还要用此产物做
pcr的模板持续扩增。
问题:
在做rt-pcr碰到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中
能够扩出我的目的基因,条带特别的好,而另一组织在相同的条件下却获取很多非特异性的
条带,试试其余条件相同没法获取满意的结果,百思不得其解!
(注:
已必定该基因在两种组
织中都表达,篇四:
rt-pcr实验方法总结大全
rt-pcr实验方法总结大全
rt-pcr实验有三步:
抽提rna,rt,pcr。
要求:
1.做rt前必需测rna浓度,逆转录系统对rna量仍是有一些要求,常用
2.rt按要求做,一般不会出太大问题。
3.pcr,按惯例。
但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完好的
500ng或1ug。
cdna存在,不
是单改变mg2+浓度、退火温度能解决的。
1)rt和pcr时的引物设计能否是必定要先知道目的基因的序列?
一定
在
rt
时,引物设计有
3种方法即
a:
random9mers
;b:
oligodt-adaptorprimer
;和
c:
特异的下游引物。
假如用
pcr的模板持续扩增。
问题:
a和
b方法,是扩增的所有的
cdna
(理论上),还要用此产物做
在做
rt-pcr
碰到一怪现象,
即对同一动物不同组织扩增同一段基因,
结果从一种组织中
能够扩出我的目的基因,条带特别的好,而另一组织在相同的条件下却获取很多非特异性的
条带,试试其余条件相同没法获取满意的结果,百思不得其解!
(注:
已必定该基因在两种组
织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的rna的量是不相同的,我测过吸光度,差别还很大,会不会和这
有关呢?
请能手赐教!
解答:
1.rt-pcr有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。
但以后发
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