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血红栓菌色素提取方法的研究
血红栓菌色素提取方法的研究
摘要
天然色素广泛存在于多种生物体内,其着色色调自然纯正、安全、价值高。
血红栓菌是一种产色素的大型真菌。
本实验通过超声波提取手段,对血红栓菌菌丝体内色素的提取条件进行探讨,筛选出一种提取血红栓菌色素的最理想和有效的方法。
实验结果证明:
血红栓菌色素在210nm处有最大吸收峰,丙酮提取血红栓菌色素的效果最好。
正交试验表明,超声功率是血红栓菌色素提取的主要因素,其次是料液比,超声时间;血红栓菌色素在室温下,超声功率120w,超声时间20min,料液比为1:
5的条件中提取的效果最佳,其OD值是2.907。
研究结果将为血红栓菌色素大规模提取生产提供依据,以此替代合成色素,减少合成色素对人体的危害和环境的污染。
关键词:
天然色素;血红栓菌;超声波提取.
Abstract
Naturalpigmentwidelyexistsinavarietyoforganisms,thedyeingishuepure,safeandhighvalue.Trmetessanguinea(L.:
Fr.)Lloydisakindoflargefunguswhichcanproducepigment.Thisexperimentthroughthemeansofultrasonicextraction,tostudytheconditionsoftheextractionofpigmentfrommyceliaofTrametessanguinea(L.:
Fr.)Lloyd,andtoscreenoutthemostidealandeffectivemethodfortheextractionofpigmentfromTrametessanguinea(L.:
Fr.)Lloydmycelia.Theexperimentalresultsshowthat,thepigmentfrommyceliaofTrametessanguinea(L.:
Fr.)Lloydhasthegreatestabsorptionat210nm,andcanreachthebesteffect,ifweuseacetonetoextractit.Orthogonalexperimentsindicatedthat,ultrasonicpoweristhemainfactorsfortheextractionofpigmentfrommyceliaofTrametessanguinea(L.:
Fr.)Lloyd,followedbyisthematerial-liquidratioandultrasonictimeisthelastone.Attheconditionsofroomtemperature,ultrasonicpowerof120W,ultrasonictimeof20minandmaterialtoliquidratioof1:
5,wecanachievethebestextractioneffectanditsODvaluesis2.09.TheresultwillprovidesafoundationforthemassextractionandproductionofthepigmentfrommyceliaofTrametessanguinea(L.:
Fr.)Lloyd.Asthepurposetoreplacethesyntheticpigmentandreduceharmtohumanbodyandpollutiontotheenvironmentcausedbysyntheticpigment.
Keywords
Naturalpigment;Trametessanguinea(L.:
Fr.)Lloyd;Ultrasonicextraction.
目录
摘要I
AbstractII
1前言1
1.1色素简介1
1.1.1合成色素1
1.1.2天然色素3
1.2血红栓菌色素提取与纯化的方法4
1.2.1血红栓菌4
1.2.2血红栓菌的作用5
1.2.3血红栓菌色素的提取与纯化的方法5
1.3试验的目的意义及技术路线7
1.3.1试验的目的意义7
1.3.2试验的技术路线8
2材料与方法9
2.1实验材料9
2.2实验试剂9
2.3主要仪器设备9
2.4实验方法10
2.4.1血红栓菌的扩培与发酵10
2.4.2血红栓菌色素提取的单因素影响10
2.4.3血红栓菌红色素最佳提取方法的正交试验11
3试验结果与分析12
3.1血红栓菌的分离和培养12
3.2不同提取条件提取血红栓菌红色素14
3.2.1血红栓菌红色素的最大吸收波长14
3.2.2最佳超声提取溶剂的选择14
3.2.3料液比的选择15
3.2.4超声功率的选择15
3.2.5超声时间的选择16
3.2.6血红栓菌菌丝体质量对血红栓菌色素提取效果的影响16
3.3血红栓菌色素最佳提取方法的正交试验17
3.4讨论18
3.4.1不同溶剂对血红栓菌色素提取效果的影响18
3.4.2料液比对血红栓菌色素提取效果的影响19
3.3.3超声功率对血红栓菌色素提取效果的影响19
3.3.4超声时间长短对血红栓菌色素提取效果的影响19
3.3.5血红栓菌菌丝体质量对血红栓菌色素提取效果的影响19
3.3.6测定方法对试验的影响20
4结论与研究展望21
参考文献22
致谢24
1.前言
1.1色素简介
色素是涵括染料、颜料等一切能吸收390~760nm范围内光波的物质总称,是生活和工业产品的重要组成部分之一。
对视觉感官信息来说,自然、悦目和谐的色泽,能够刺激和增加人们的食欲以及美化人们的心情,提高了商品的市场价值和地位。
虽然物品具有一定的颜色,但其敏感性在加工与贮存过程中可能会造成褪色或者变色。
为了保持和改善色泽,在加工过程中可能需要用色素进行人工着色。
色素的应用在食品、化妆品及医药工业不断扩大,人们对其需求量也在不断增大。
随着现代医学、毒理学和分析化学的逐渐发展,合成色素的危害也逐渐显现出来,人们逐渐由对合成色素的需求转变为对天然色素的需求。
但是当前的天然色素远远不能满足现代生活和工业的需要,开发天然色素新品种以及对原有天然色素生产工艺的改造,己成为非常迫切的问题[1~2]。
1.1.1合成色素
1.1.1.1合成色素的概念
合成色素是指用人工化学合成方法所制造的有机色素。
其大多以苯、甲苯、萘等煤焦油化学产品为原料,经过偶氮化、磺化、硝化等一系列化学反应合成。
其生产工艺简单、成本低廉、色彩鲜艳、着色力强、坚牢度大、性能稳定、易于着色并可任意调色、使用方便、用起来得心应手,以至于在生产和生活中广泛应用[3]。
这些色素的分子量大多在450~880之间,最大吸收波长集中在428~630nm之间;耐热、耐光性能比较稳定,耐氧化、还原性能均较差,强酸强碱条件下不太稳定[4]。
1.1.1.2合成色素的危害
合成色素大多带有毒性,主要是其化学性能影响人体健康或使人体受到损害.食用偶氮色素在强还原剂作用下,R-N=N-R比较容易断裂,被还原成两种具有致癌性物质:
α-萘胺、β-萘胺。
在加工过程中,砷、铅、氯化物等化工产品也会对合成色素造成污染,对人体造成危害[5]。
另外,合成色素的使用和生产也造成了环境污染。
(一)对人体健康造成危害
(1)引起不耐受与过敏
有的合成色素常常会引起人们产生原因不明的食物不耐受和过敏。
人类的剥脱性皮炎、反胃、呕吐、腹泻、湿疹、风疹、支气管痉挛、偏头痛、过敏性反应、多动症及其他行为混乱等都有可能因合成色素引起[6]。
(2)引起多动症和学习障碍
多动症是一种比较常见儿童心理疾病,患儿通常缺乏自我控制能力,专注力不足,过分好动,情绪容易失控,做事冲动,不考虑后果。
该病和饮食、行为有很大的联系。
国外David[7]等采用了Meta—分析模型确定来分析人工色素是否是引起多动症的原因,从而确定了神经行为学毒性是广泛使用化学物质的特征表现。
(3)影响机体正常代谢与生长发育
经研究,发现某些合成色素会增加体内甲状腺激素含量而导致甲状腺机能亢进,以高剂量姜黄素来喂猪进行试验,结果发现其能增加猪甲状腺重量并引起严重的甲状腺损害[8]。
婴幼儿和儿童若食用含有合成色素的食品后,合成色素会在体内蓄积过多,且消耗体内的解毒物质与干扰正常的代谢功能,导致腹胀、腹泻和营养不良等症[9]。
(二)合成色素对环境的污染
自从有了第一个合成色素后,各种合成色素源源不断地得到研制和开发,其中至少有上万种大量应用于工业、商业领域,而5%~10%的合成色素被排放入环境中,其品种和数量的增加引发了环境污染问题[10]。
我国色素废水年排放量高达1.5亿吨左右,其中大部分都是未经处理而直接排入环境水体中,全球每年至少消耗约70万吨各种染料和色素[11]。
目前人们已在多种环境介质中,如空气、水、土壤和食品等,检出了难于降解的人工合成色素及降解后二次污染物。
空气中的色素来源于其生产和使用过程,它们主要吸附在烟尘颗粒物上,随着颗粒物发散于环境各处。
未经处理色素废水偷排造成地表水与地下水受污染,进一步使得河道底泥和周边土壤中含有大量色素沉淀。
大气污染严重的地区土壤中的色素废料含量也较高。
此外,污水灌溉、污泥农用、工业渗漏等都会使土壤遭受它们的严重污染[12]。
鉴于合成色素对人类健康的危害性,全球尤其是西方发达国家不仅在色素对人体健康影响方面做了大量调查和研究,并且在合成色素的管理、合成色素的使用方面均有严格的规定。
而天然色素来源于大自然,其中大部分来源于植物,部分来源于动物和微生物。
在倡导“绿色运动”的今天,天然色素的发展前景更加看好[7]。
1.1.2天然色素
1.1.2.1天然色素的概念和发展简史
天然色素是人们通过一定的技术手段从自然界的动植物细胞组织中获得的色素,与合成色素相比,它们具有无毒、色彩自然的特点,并且大多数的天然色素还具有一定的保健、营养及药理作用[13]。
19世纪中叶以前,人们都是使用的是比较粗制的天然色素。
人类最早使用的天然色素可以追溯到古埃及,大约在公元前1500年,当地的糖果制造商就利用天然提取物和葡萄酒来改善糖果的色泽。
我国天然色素的制备及使用具有悠久的历史。
据《史记之货殖传》记载,公元前221年以前的东周时期就有“茜桅千亩,亦比千乘之家”之说;宋朝时期,福建、浙江一带人民就用红曲霉菌发酵制造红曲米和酒;北宋贾思勰的《齐民要术》中也专门提到我国古代人们从植物中提取色素作为染色剂使用的事例,详细记载了红花栽培和制备色素的方法。
近些年来,随着人类对化学合成色素的认识和对生活质量要求的提高,天然色素的应用和开发越来越受到人类的关注和重视[4]。
1.1.2.2天然色素的种类和来源及功能性质
(一)类胡萝卜素类色素
(1)类胡萝卜素
β-胡萝卜素在食物中含量最丰富,是人体维生素A的前体和主要来源。
在酶作用下,人体内一分子的β-胡萝卜素可转变为两分子的维生素A,因此被认作研究表明[14],维生素A能提高机体的免疫机能,能抵御紫外线的辐射,预防维生素A缺乏症,可防治中风、心肌梗塞等心血管疾病。
(2)叶黄素
叶黄素主要存在于玉米、柑橘等植物中,是单线态氧及自由基的清除剂,可阻止脂质过氧化反应的链式传递。
很早以前,西方医学研究人员就发现[15]天然叶黄素可预防人体衰老有关的一系列疾病,如它可预防老年性视力下降或失明。
(二)黄酮类色素
黄酮类色素是一种带有C6-C3-C6的水溶性酚类物质,它可以捕捉到生物体内膜脂质过氧化自由基和超氧化物,从而切断了体内导致衰老和疾病的脂质过氧化连锁反应,同时还具有螯合金属离子、阻断氧化酶的作用。
(三)花色苷类色素
花色苷类色素一般存在于植物的花、叶和果实中,是由糖苷配基和糖组成的。
一般情况下为水溶性,受pH值的影响后会变色,对光、温度和氧敏感。
花色苷能吸收紫外光,可起到紫外屏障作用,推迟癌细胞的生长。
同时它一定程度上预防冠心病和心肌缺损、循环紊乱和心绞痛。
(四)叶绿素(卟啉类色素)
叶绿素存在于藻类和高等植物的叶、果中,对光不稳定。
研究发现,其具有补血、造血、活化细胞、抗菌消炎、抑制癌细胞生成的功效[16]。
1.1.2.3天然色素的优点
与合成色素比较,天然色素优势很明显:
(1)纯天然,无毒副作用,安全性高;
(2)有的还具备一定的营养价值;(3)有的还具有一定的药理和保健功能;(4)天然色素着色色调自然,接近物质本身颜色。
天然色素的诸多优点,使其在食品、化妆品以及医药等各个行业的应用随处可见[17]。
1.2血红栓菌色素提取与纯化的方法
1.2.1血红栓菌
血红栓菌Trametessanguinea(L.:
Fr.)Lloyd隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、栓菌属。
血红栓菌菌盖扁半球形至扁平,木栓质,无柄,半圆形或扇形而基部狭小,橙色至红色,后期褪色,无环带,有微细绒毛至无毛,稍有皱纹,2~7×3~11cm,厚5~20mm;菌肉橙色,有明显的环纹,遇氢氧化钾时变为黑色,厚3~6mm,菌管长2~4mm,管口红色,每1mm2~4个。
孢子圆柱形,无色或微黄色,光滑,5~7×2~3μm。
血红栓菌与红孔菌的不同之处是,血红栓菌菌盖厚2~6mm,每1mm内有管孔5~7个。
血红栓菌夏秋季生于栎、槭、杨、柳等阔叶树以及松、杉等针叶树枯倒木上子实体单生、群生或叠生;在我国主要分布于云南、贵州、广东、四川和重庆等省市[18]。
属木腐菌,被害木材初期染以橘红色,后期呈现为白色腐朽。
血红栓菌具有生肌、行气血、化痰、止痒、顺气、止血,清热除湿、消炎、解毒作用,可治口腔炎和菌痢;有抑制癌细胞作用,对小鼠肉瘤180的抑制率为90%。
血红栓菌子实体还含有对革兰氏阴、阳性菌有抑制作用的多孔蕈素。
此外,还用于消炎,用火烧研粉敷于疮伤处。
血红栓菌还可以转化一种罂粟碱—蒂巴因碱,获得新型止痛药。
还可以采用血红栓菌以阿魏酸为前体物质进行发酵生产的香兰素,是食品工业中应用最广泛的香料之一[19]。
1.2.2血红栓菌的作用
1.2.2.1降解木质素
木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果,其中真菌起着主要作用。
血红栓菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素,机理是:
首先是产生H202的氧化酶,在氧参与下氧化相应底物激活过氧化物酶,启动酶催化循环,并且合成对降解木质素的漆酶(1accase)。
漆酶是氧化酚类物质,它能生成并借助醌自由基,与木素的部分分解一起发生高分子化,导致侧链和芳香环裂解。
在这过程中,木质素降解酶借助自身形成的H202,启动一系列的自由基链反应,形成活泼的酶中间体,将木质素等有机物氧化成许多不同自由基(R-)和强氧化性的羟基自由基(-OH),实现对木质素的生物降解。
1.2.2.1降解纤维素和半纤维素
血红栓菌对纤维素的降解中,它们在有纤维素存在的情况下可产生降解纤维素的酶系。
降解机理为:
首先由内切型葡聚糖酶在纤维素的非结晶部位进行切割,产生新的末端,然后再由外切型葡聚糖酶以纤维二糖为单元进行末端水解,最后由纤维二糖质为单元进行末端水解,这些酶是协同降解纤维素的[20]。
1.2.3血红栓菌色素的提取与纯化的方法
1.2.3.1溶剂提取法
由有机溶剂浸提,然后过滤、减压浓缩、真空干燥精制等工艺过程得到最终产品。
根据色素性质、所用原料不同而选择不同溶剂。
常用溶剂有:
水、酸碱溶液、有机溶液(如乙醇、丙酮)以及二氧化碳等。
此法工艺简单,设备投资少,提取操作方便,对环境无污染,成本低,便于生产。
但存在浸提时间长、色泽变化较大等缺点[21]。
1.2.3.2碱提取法
碱提取法主要是应用碱对多种生物物质的影响作用。
其提取效率不是很高,但从经济角度和安全性考虑仍有应用价值。
碱提取辣椒红色素是以15%~40%的NaOH处理辣椒油树脂,使辣椒红色素的脂肪成分发生皂化反应,从而使辣椒红色素释放出来,再分离精制可得到产品。
但碱提法却需要消耗大量酸碱,且废液较难回收[22]。
1.2.2.3微波技术辅助萃取
微波技术辅助萃取是将微波激活与传统的溶剂萃取法结合起来而形成的新型萃取技术。
其基本原理是,在微波场中吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被萃取物质从基体和体系中分离。
与传统萃取方法相比,该技术具有选择性高、萃取时间短、溶剂消耗量少、色素成分萃取率高、不产生噪音、操作成本低、减少原料预处理并对环境友好、适合于热不稳定物质等特点。
与超临界流体萃取相比,微波萃取仪器设备比较简单、廉价,而且适用面广,较少受到萃取物极性的限制[23]。
1.2.2.4酶法提取
对于一些被细胞壁包围不易提取的原料可用酶法提取。
不同的纤维素酶制剂作用于同一种植物材料时,有效成分提取率的高低不仅与制剂中纤维素酶的含量、活性有关,也与酶制剂中半纤维素酶、果胶酶等的含量、活性有关。
因此,应对不同来源的纤维素酶进行筛选,以获得与植物材料匹配的、具有最大提取率的纤维素酶[24]。
1.2.2.5超声波辅助萃(提)取法
超声波萃取技术就是一种新型的分离技术,其原理是:
它是由超声波发生器将输入的交流电转化为高频交流电信号,再通过超声波换能器将高频信号转换而成的高频机械振动。
超声波越是波长短、频率高,越是能量高、穿透能力强、束射性和方向性好。
其独特的优点和广泛应用的基础在于超声波的空化作用和次级效应。
(1)空化作用:
空化作用是指超声波在液体中传播时,使液体微粒之间发生相对流动和振动而产生无数的真空微小气核,这些微小气核在超声场作用下发生的振荡、长大、破碎及闭合等一系列动力学过程。
(2)湍动效应:
湍动效应主要是超声波在媒质中传播时,空化作用产生的微射流和冲击波加速体系的湍动和固体颗粒间的碰撞,使固体微粒获得高加速度和动能,固体表面不断被剥离变薄、产生新的活性表面,从而增加固液接触面积,加快传质速率。
同时其产生的强烈的物理剪切作用,使细胞损伤、破裂并释放出内含物,并促使提取液向胞内扩散渗透,提高提取率。
(3)聚能效应:
聚能效应是指空化泡在超声场作用下破碎、聚集的能量瞬时释放时,产生的局部高温高压可能破坏固体微粒之间的次级键,降低相互作用力,从而提高传质速率。
同时在介质中传播时,聚集的能量不断被介质吸收,转变为热能,使体系温度升高,有利于有效成分的溶解,提高有效成分的获得率[25]。
但是超声波破碎中溶剂的选取应满足以下几点:
(1)所选溶剂不能与被测组分发生化学反应;
(2)所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收;(3)所选溶剂对被测组分有较好的吸收能力;(4)被测组分在所选溶剂中具有良好的吸收峰形[26]。
1.3试验的目的意义及技术路线
1.3.1试验的目的意义
自从1856年英国人PerkinsWH合成了第一个合成色素苯胺紫以来,相继又合成了许多新的色素。
这些色素色泽鲜艳、易于溶解、性质稳定、品质均一、着色力强、适于调色以及成本低廉而被广泛使用。
但是随着药理毒理学与分析化学的发展和人们生活水平的提高,人们发现有些合成色素会对人体健康以及环境造成危害。
其危害包括一般毒性、致泻性、致癌性与导致基因突变性,因而色素安全性越来越受到人们关注。
近年来,服装行业的毒牛仔裤以及食品行业等色素事件被频频曝光,使人们对合成色素的安全性格外警惕,甚至谈色惊心。
与合成色素相比较,天然色素具有无毒无害、安全性高,有一定价值,用天然色素着色,色调纯正,接近天然物质的颜色等许多特点。
它不但广泛应用于染织、干料、酒类、糕点等行业中,以改善其外在品质,而且也应用于医药和化妆品的生产。
其广泛存在于多种生物中,自然界中微生物能产色素的种类众多,通过微生物大规模培养,以发酵手段进行色素生产,不受资源、环境以及空间上的限制,是一种高效、低成本获得目标色素的有效途径。
目前国内外的研究大多都集中于对血红栓菌菌丝体发酵和血红栓菌产多糖以及胞外漆酶的研究,而对血红栓菌产色素研究至今还未见报道。
本次试验首次尝试血红栓菌所产色素的提取,通过血红栓菌色素的提取进行探索,为仍处于不成熟阶段的血红栓菌所产色素的提取筛选出一种理想的、有效的提取方法,其所获的数据和经验将为今后的大规模生产提供理论依据,从而替代合成色素,减少合成色素对人体的危害和环境的污染及破坏。
1.3.2实验的技术路线
血红栓菌的野外采样
提取血红栓菌工艺菌种
血红栓菌纯化和培养
收集菌种
正交试验
最佳提取液的选择
最佳超声波破碎条件的确定
最佳料液比的确定
最佳超声溶剂的选择和确定
1:
5
1:
10
1:
20
1:
30
不同超声功率、时间
紫外可见光分光光度计测OD值
分析和处理数据,获得最佳提取方法
2.实验与方法
2.1实验材料
供试真菌:
血红栓菌,由宋福强老师从小兴安岭丰林国家自然保护区采集并获得血红栓菌子实体。
液体培养基在超净台内过滤,弃去培养液,获得黄红色的圆粒菌丝体,称菌丝体每份湿重1.0g若干份,备用。
2.2实验试剂
无水乙醇,丙酮,甲醛,石油醚,去离子水,正己烷,氯仿。
以上试剂均为分析纯。
2.3主要仪器设备
仪器设备名称
型号
生产公司
紫外可见光光度计
TU-1810
北京普析通用仪器有限责任公司
超声波细胞破碎仪
JY92-
DN
宁波新芝实业有限公司
手提式压力蒸汽灭菌器
YXQ-SG46-280S
上海博迅实业有限公司
电热恒温培养箱
———
上海一恒科学仪器有限公司
超净工作台
———
———
2.4实验方法
2.4.1血红栓菌的扩培与发酵:
据研究表明[27],碳源对血红栓菌菌丝体生长的影响大小依次为:
葡萄糖>乳糖>玉米粉>可溶性淀粉>基础培基>蔗糖。
因而我们选用PDA培养基。
(1)菌种分离、纯化:
在超净台内,取已风干表面游离水分、新鲜而无病虫害的血红栓菌子实体,将子实体轻轻撕开,用手术刀从菌盖的菌肉内部划取0.2cm×0.2cm大小组织块,接种于PDA斜面,然后放入25℃培养箱内培养;待组织块分化,生长菌丝后挑取菌丝进行转管纯化。
挑选培养过程中菌丝生长均匀一致,斜面纯培养,置于4~5℃冰箱内保存备用[28]。
(2)血红栓菌的扩培与发酵:
从保存试管培养基斜面上挑取单菌落接种于PDA培养基中,25℃,恒温培养4天,将菌丝转接于装有液体培养基的250mL三角瓶中,总共6瓶,放于25℃、110r/min恒温摇床培养9天,超净台内过滤,弃去滤液,得圆粒型的黄红色菌体[29~30]。
2.4.2血红栓菌色素提取的单因素影响:
(1)血红栓菌红色素的最大吸收波长:
称取1份湿重为1.0g的血红栓菌菌丝体,加入丙酮溶液30mL,室温下浸提2小时后过滤,得出滤液,放在紫外分光光度计内进行波普测定。
(
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