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药品生产企业检验细菌学基础知识
第六篇微生物限度检查基础知识
细菌的大小与形态
细菌是一类具有细胞壁与核质的单细胞微生物(分类上属原核生物界)。
其个体微小,以微米(μm)为测量单位,以显微镜放大数百倍至上千倍才能看到。
细菌的基本形态可分为球菌、杆菌及螺型菌三种(如下图)
第一章细菌学基础知识
细菌数测定方法
测定供试药品每克或每毫升中污染细菌的数量,是检测药品受到微生物污染程度的重要标志。
细菌数测定的方法:
★平板计数(平皿法) 目前采用最广泛的测定方法,应取适宜的连续2~3个稀释级的供试液,此方法操作较明了易学习,但要掌握其中的操作技巧,才能将减小误差,达到数据准确无误。
☆操作技术注意事项
A供试品检验全过程须符合无菌技术要求,使用灭菌用具时,不能接触可能污染的任何器物,吸管不能用口吹吸
B用酒精灯时,切勿在火焰正上方。
以免将供试品内细菌杀死。
C净化工作台操作应避免双手来回出入工作台,无菌室内避免操作者来回出入无菌室。
D溶于水的供试品须助溶后进行试验,避免实验误差,稀释供试品时须每一稀释度换一支吸管。
F取供试液注入平皿,要取均匀供试液,注皿时培养基应水浴保温45±1℃倾注培养基于平皿中与样品须摇匀。
从供试品稀释,注平皿倾注培养基,全部操作应1h内完成,时间过长导致细菌繁殖或死亡。
☆异常情况处理
最常见的是落菌过多,蔓延,以至掩盖另些菌落,干扰计数。
防止以上情况可
(1)加TTC,每100ml营养琼脂内加灭菌1%TTC溶液1ml。
(2)开盖干燥,将已凝固的琼脂平板开该于净化太上,开机1~2h后再培养。
(3)换陶瓦盖,将平板盖换上干热灭菌的陶瓦盖。
★培养基稀释法
适用于含抑菌成分的供试品,是将供试液3份,每份各1ml,分别注入5个平皿中(每平皿约0.2ml),每个平皿倾注营养琼脂,混匀、凝固后,培养即可。
5个平板点计的菌落之和,即为1ml菌落数,共得3组数据,以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
★薄膜过滤法
2005版药典新收载的方法,其原理是通过滤膜,将细菌留集在滤膜上,然后将滤膜放置在营养的基质上(如营养肉汤琼脂平板),经培养,微生物从滤膜空隙中吸收营养,在滤膜上增生,形成菌落。
采用薄膜过滤法虑膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50μm,使用前均须灭菌。
虑膜消毒前应于清水中浸泡4h以上,装上滤器时不宜过紧,以免虑膜变形。
供试液经薄膜过滤后,冲洗量须验证,每冲洗量为100ml,过滤速度不宜过快。
贴膜时注意菌面朝上贴于平皿上,而且须从平板的一边慢慢贴起,以免产生过多的气泡,影响计数。
★以上实验中常选用的三种方法都要根据2015版药典要求进行每种产品的方法验证,只有符合验证要求才能选用。
第二章酵母菌及霉菌基础知识
酵母菌及霉菌基本概念与形态
(一)酵母菌酵母菌是真菌的一部分,为单细胞,一般圆或卵圆形,亦有柠檬形,腊肠形,三角形、瓶形、菌丝形,个体比细菌大,在低倍显微镜下可见到。
酵母菌在玫瑰红钠琼脂平板上的菌落表面湿润、不透明,边缘整齐,粘稠、类似细菌菌落,但多数为圆形乳白色,少数红色,微凸,边缘整齐,少数呈毛状,偶有干皱型,酵母菌为单细胞,无菌丝,故菌落不深入基质,与培养基结合不紧密,用接种环挑起拉丝,并在水中易分散,当平板内菌落多时常有酒香味。
(二)霉菌霉菌亦称丝状真菌,是属于真菌类。
凡生长在营养基质上形成绒毛状,蜘蛛网状,或絮状菌丝的真菌,统称为霉菌。
霉菌在固体培养基上最初形成一个特征的圆形轮廓的菌落,发育后期,菌丝向四周蔓延形成棉絮状,蜘蛛网状,毯状或绒毛状的菌落。
菌落生长过程中,有的出现同心圆或放射纹。
在一定培养时间内扩展到整个培养皿(如根霉和犁头霉)。
大多数霉菌的菌丝透明无色,但有些能产生色素,使菌丝呈暗褐色至黑色(如霉曲菌),或呈鲜艳的颜色(如青霉菌呈鲜明的颜色,木霉呈不同程度的绿色)。
霉菌菌丝与培养基连接紧密,不易挑起,外观干燥。
酵母菌及霉菌的生长繁殖与培养特征
(一)酵母菌和霉菌均属于真菌,有如下特征:
1、培养基一般含有较高浓度的糖或盐,营养要求不高,药品中一般用玫瑰红钠琼脂培养基就能满足要求。
2、pH范围较广,适于5.0~6.5范围,最适宜生长温度为20~30℃,多数菌种35℃以上不能生长。
3、繁殖力强,但生长速度较慢,一般需要72h至一周,甚至更长。
(二)酵母菌的生长繁殖
通常以出芽繁殖,少数分裂繁殖,细胞成熟后长出小芽,小芽成长一定时候脱离母细胞形成新的个体,有的不脱落在芽体上生长出新的小芽,可见一个细胞连同几个小细胞。
大多数酵母菌细胞中有一个至数个液泡,故用接种环挑起拉丝。
(三)霉菌的生长繁殖
霉菌的繁殖能力很强,方式多样,主要通过有性或无形的方式产生孢子繁殖,孢子萌发后,生长菌丝并交织成为肉眼可见个体或群体,其形状也随之不同。
酵母菌及霉菌数的测定方法及注意事项
(一)测定方法:
主要采用平皿法和薄膜过滤法,同细菌测定方法。
(二)注意事项
1、细菌与酵母菌的区别:
均是单细胞微生物,均可在玫瑰红钠平板及酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板上生长,形态具有类似特征,如较湿润,光滑,易挑起,菌落正、反面及边缘,中心的颜色较一致,质地均匀等。
但酵母菌菌落单个较大,在琼脂平板上凸起较高,无光泽,呈边缘整齐的正圆形,乳酪状,表面易挑起并起丝。
产生的色素较单一,常为白或奶油色,少数为红色(纯化水中)或黑色,直观不能判别的可用显微镜检验,以便区别。
2、霉菌菌落计数时,平板不宜反复翻动,防止孢子散落并长成菌落影响计数。
如果酵母菌在玫瑰红钠琼脂中生长不理想、可凝时,应挑取单个典型菌落接种至酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板上培养,并进行显微镜鉴别
3、在培养过程中有时为了限制霉菌菌丝的生长,可在培养基中添加0.1~0.5%的去氧胆酸盐
第三章菌种保藏
菌种保藏意义及目的任务
(一)菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料,也是微生物有关部门的重要生产资料,因此菌种保藏是一项重要的基础工作,是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
(二)菌种保藏的目的和任务
菌种保藏研究就是要研究各类菌种最合适的保藏方法,使菌种变异和死亡达到最底限度,也是药品微生物检验工作中的一项常用技术。
(三)菌种保藏与管理程序
保存的菌种必须具备该菌种的详细历史及有关试验资料。
一般填写菌种卡片,菌种名称编码,来源历史、形态特征、培养特征、传代次数、保藏方法、培养条件等须交专职管理人员保藏处理。
定期检验其存活率,种株纯度及有关特征。
一二类及专利菌种应设有专库或专柜单独保藏。
常用菌种的保藏方法
(一)菌种保藏的原理
根据微生物的菌种生理,生化特性,在人工创造的条件下尽力降低微生物细胞的代谢强度,使细胞基本处于休眠状态,生长繁殖受到抑制但又不死亡,减低菌种的变异率。
(二)常用菌种的保藏方法
菌种保藏有四阶段:
a挑选特征典型的纯菌菌落b确定保藏的合适菌体形态,凡能生产孢子微生物都用孢子和芽孢进行保藏c选择最适合的保藏方法d定期检查
1、琼脂斜面低温保存法
(1)方法:
将常用菌种的典型菌落接种于斜面上,按规定温度和时间培养,充分生长后,用牛皮纸包好,至4度左右冰箱保藏。
每隔2~3个月移种一次。
(2)适用的范围:
适用于经常使用的细菌,酵母菌、防线菌和霉菌保藏。
(3)特点:
简便,易于推广;不需另加选择保藏用培养基,对多数微生物适用,但保藏期太短,传代次数多,易发生变异及污染。
(三)注意事项
a、菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物,至少应是养三代。
b、保藏时,破伤风杆菌可用庖肉培养基,生孢梭菌用体硫乙醇酸盐培养基,乙型溶血性链球菌、肺炎球菌用血肉汤(或琼脂)培养基。
c、须定期检查保藏菌中冰箱的温度,湿度及菌种管是否松动或生霉。
d、每接种传代后,应与原种编码、名称、核对,确认无误再保藏
e、铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶死亡,不一用本法保存,因为它42℃生长,4℃不生长,故只需常温保存即可。
2、液体石蜡保存法
即将菌种接种于斜面或穿刺培养于半固体高层培养基中,用化学纯液体石蜡封于斜面上端1cm,放入冰箱中保藏。
此法只适用于部分霉菌,酵母菌和放线菌保藏,保存酵母菌,一般可保存一年至数年。
但对细菌效果差。
除上述两种方法外,还有沙土管保藏法、麸皮保藏法、冷冻真空干燥保藏法、滤纸保藏法等,一般实验室均多采用琼脂斜面低温保藏法和液体石蜡保存法。
菌种的复壮
使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性,称为复壮
复壮的常用方法有以下几种:
1、分离纯化
2、通过缩主复壮
3、淘汰退化
4、理化因素诱
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