基因疗法论文3号 高阳改指南.docx
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基因疗法论文3号高阳改指南
从发育生物学浅谈基因疗法时间表
化生学院生物系生物07本3号高阳
【摘要】:
10多年来,基因疗法不断在新领域取得成功,世界上已有逾千名患者进行了这方面的治疗。
基因疗法的对象现已包括血友病、严重贫血、关节炎、心血管病、癌症,甚至艾滋病等15种以上疑难顽症。
有专家估计,人类的疾病有一大半可望利用基因疗法来治疗,而且可以达到根治的效果。
随着基因疗法的发展,也带出了很多的安全隐患和伦理道德问题。
据信,随着研究的深入和基因治疗的不断完善,那些已出现或潜在的问题会逐渐解决。
正如基因治疗专家们所说,再给科学一次机会,加上科学界的共同努力、公众的理解和支持,基因疗法依然前景无限。
【关键词】;基因疗法;对象;技术障碍;安全隐患;前景
今年,美、英、法、德、日、中等国科学家共同宣布,人类基因组工作草图已经绘出,人体全部基因的初步测序研究工作已经完成,科学家们将深入研究与各种疾病有关的基因、疾病基因与其他基因及环境的相互作用等。
预计到2010年或2020年,基因疗法将成为一种普通的治疗方法。
20世纪80年代初,随着分子遗传学的研究深入,特别是医学分子遗传学研究进展和应用,许多遗传病的发生机理在基因水平上被揭示,这样就有可能从基因水平上去诊断和医治遗传病。
检测表明,遗传性疾病中的大多数是由于单个基因突变所引起的。
随着DNA体外重组技术的不断完善,与遗传病有关的基因不断被分离、克隆、分析,同时又由于基因转导效率的不断提高,将这些技术和理论用于人类本身就必然成为广大科学工作者所追求的目标。
因此,基因治疗的设想一经提出,便以惊人的速度发展起来。
虽然这种设想在科学界、宗教界以及社会伦理及道德法律方面产生了巨大的震动并出现了一些非议,但这并不能阻止该科技的不断深入和发展。
仅在短短的20多年里,从理论转化为实践,从实验室走向临床,基因疗法成为分子生物学与医用分子遗传学的结合部,现已成为多学科相互渗透的研究及技术开发热点。
那么什么是基因疗法呢?
所谓基因疗法:
就是采用分子遗传学技术,以相应的正常基因去代替有缺陷的基因,或选择地使有害基因失活,从而达到治愈疾病的目的。
基因工程目前正在突飞猛进发展,不断渗入医学诸领域中,推动着医学的发展。
基因工程在医学方面最主要的应用是解决人类遗传性疾病的诊断和治疗问题。
遗传性疾病发生的原因是由于病人细胞内脱氧核糖核酸上的遗传密码(基因)发生错误。
所以这种疾病目前只能治标,不能治本,这给病人及其后代带来很大不幸。
但基因工程技术发现,遗传密码对一切生物都是通用的,不受生物种类的限制。
这样,通过基因工程技术,就有可能利用健康人的正常基因或者别种生物乃至微生物的有关基因,把它们移植到病人细胞内,来取代或者矫正病人所缺陷的基因,以达到根治遗传性疾病的目的。
基因疗法有如下几种:
1)显微注射法 用显微注射,将脱氧核糖核酸(DNA)注入到靶细胞的核内,所注入的DNA只要达到被注射细胞的10%,即可形成稳定的新基因型;
2)同源重组法 是通过基因交换,直接用新的基因片段,来代替有缺陷的基因片段;
3)反转录病毒载体法 是目前最盛行的,利用反转录病毒作载体,进行基因转移;
4)磷酸钙沉淀法 用于体外生物系统基因转移。
目前有三种转基因载体:
病毒型、非病毒型和物理型。
许多病毒可被改造成为载体,其中用得较多的是逆转录病毒Rv、腺病毒Ad、腺病毒相关病毒AAV。
也有人试用痘病毒特别是牛痘、单纯疱疹病毒。
非病毒载体分为三种主要类型:
裸DNA、DNA与阳离子脂类的复合物、阳离子聚合物将DNA压缩形成的颗粒,其中有些是包含在脂质体中。
物理方法主要包括无针注射、电穿孔。
以上方法中目前以病毒载体最有效,它们的缺点是插入基因片段大小有限、有免疫原性、生产流程复杂。
非病毒方法效率较低,特别在invivo中,表达的时间不长,但它没有插入基因片段大小限制、免疫原性低、生产流程简单。
物理方法转染效率低,但某些应用方案有一定前景。
主要的转基因载体的比较
载体
优点
缺点
逆转录病毒RV
比较稳定的基因表达免疫原
性低,无细胞毒作用exvivo实
验中转染效率高有丰富的ex
vivo临床实验适用的宿主细
胞范围较广
只感染分裂中的细胞
invivo实验中转染效率低
病毒基因组随机插入可能引起宿主细胞
变异
同源重组可能产生具有复制能力的病毒
生产、贮存、质量控制难度大
能容纳的外源基因仅达10kb,
亦有文献称8kb
腺病毒
exvivo、invivo实验中均表现
出相当高的转染效率分裂中
和非分裂中的细胞均可转染
有丰富的exvivo临床实验
定位转染能力强
能容纳的外源基因仅达7.5kb
重施会引起强烈的免疫
生产、贮存、质量控制难度较大
不能整合,表达持续时间较短载体基因组复杂化
腺病毒相关病毒Av
invivo能转染许多种细胞,
包括不分裂细胞
野生型只整合人类第19号染色体
invivo持续表达
免疫原性低
不致病,无毒性
能容纳的外源基因仅4.5kb
生产、质量控制难度大
临床实验不多
整合后有潜在的感染性
重复施用会引起抗体反应
重组载体中缺少专一性整合
需要腺病毒或疱疹病毒帮助
进行复制
慢病毒属Lentivirus
分裂中和非分裂中的细胞均
可转染
能转染造血干细胞
比较稳定的基因表达
有逆转录病毒或VSVG病毒外
壳的假型病毒,适用的宿主
细胞范围广
能容纳的外源基因仅达10kb
亦有文献称8kb
无临床实验
生产、贮存、质量控制难度大
在血清中可能向HIV-1转变
存在tat和rev调节蛋白以及其
它一些HIV-1调节蛋白
裸DNA
生产、贮存和质量控制简便
免疫原性非常低
在临床实验中表现出良好效果
非常安全
在大部分组织中表达时间非常短
exvivo和invivo转染效率非常低
无重定位(retargeting)转染能力
阳离子脂类
生产、贮存和质量控制较简便
exvivo转染效率高
免疫原性低
非常安全
invivo转染效率低
表达的时间非常短
临床实验不多
无重定位转染能力
压缩DNA颗粒
生产、贮存和质量控制较简便
exvivo转染效率高
免疫原性低
非常安全
有重定位转染能力
invivo感染效率低
表达时间非常短
无临床实验
目前最盛行的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞(如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等),然后利用对人体无害的逆转录病毒当载体,把正常的基因嫁接到病毒上,再用这些病毒去感染取出的人体细胞,让它们把正常基因插进细胞的染色体中,使人体细胞就可以“获得”正常的基因,以取代原有的异常基因;接着把这些修复好的细胞培养、繁殖到一定的数量后,送回患者体内,这些细胞就会发挥“医生”的功能,把疾病治好了。
美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症(ADA缺乏症)的基因治疗,是世界上第一个基因治疗成功的范例。
1990年9月14日,安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩进行基因治疗。
这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷,自身不能生产ADA,先天性免疫功能不全,只能生活在无菌的隔离帐里。
他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中,这种白血球都已经过改造,有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。
在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗,同时也接受酶治疗。
1991年1月,另一名患同样病的女孩也接受了同样的治疗。
两患儿经治疗后,免疫功能日趋健全,能够走出隔离帐,过上了正常人的生活,并进入普通小学上学。
基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。
这种病人由于细胞内缺少基因G,不能产生半乳糖—1—磷酸—尿苷酰转换酶,以致大量半乳糖—1—磷酸和半乳糖堆积在肝组织中,这些半乳糖可转变为酒精,因而造成肝脏损害。
临床表现为:
小结节性肝硬化、呕吐、腹泻、营养不良、黄疸、腹水、白内障、智力发育迟钝、半乳糖血症、半乳糖尿、氨基酸尿等。
为了治愈这种病人,人们把大肠杆菌(一般内含G基因)能产生半乳糖酶的脱氧核糖核酸片段提取出来,让噬菌体作为运载体带入病人的细胞内,病人细胞便开始产生半乳糖酶。
这样,原来不能利用半乳糖的细胞便恢复了对半乳糖的正常代谢。
如果再将这种已经治愈的细胞用人工的方法移植到人体器官内,使之成为人体的正常部分,那么这种病就从根本上治愈了。
而且由于病人细胞内脱氧核糠核酸的缺陷部分得到了纠正,这种病也就不会再遗传给下一代了。
随着研究的不断深入,基因疗法也取得了一系列的成果。
10多年来,基因疗法不断在新领域取得成功,世界上已有逾千名患者进行了这方面的治疗。
基因疗法的对象现已包括血友病、严重贫血、关节炎、心血管病、癌症,甚至艾滋病等15种以上疑难顽症。
有专家估计,人类的疾病有一大半可望利用基因疗法来治疗,而且可以达到根治的效果。
基因疗法对癌症的治疗:
不久前,在2000生物技术中国国际论坛大会”上传来喜讯,我国现有胃癌、肝癌、恶性脑肿瘤以及其他一些顽症的基因治疗方案已经进入或年内进人临床试验,科学家们有希望攻克严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,基因疗法再度引起世人的广泛关注。
美国利用基因疗法治愈2名癌症患者。
现年53岁的马克·奥利杰尔来自美国威斯康星州,育有2个孩子。
1999年,奥利杰尔被诊断患有恶性皮肤癌。
此后,他与癌细胞搏斗了5年时间,但是效果都不太理想。
2002年,主治医生在其背部长出的囊肿中发现了恶性细胞,癌细胞随后持续扩散。
2004年,奥利杰尔的肝脏中也被发现了癌细胞。
各种化疗和外科手术都未能阻止奥利杰尔体内的癌细胞扩散。
2004年12月,奥利杰尔“无意中”接受了基因疗法,并于当月出院。
2005
年,奥利杰尔的肿瘤萎缩了一半。
到去年,奥利杰尔的身体状况已好得足以出席女儿的婚礼,那时,他全身只有肝脏部位还有一小块肿瘤。
之后,奥利杰尔通过外科手术切除了这块肿瘤。
今年月底,主治医生告诉奥利杰尔,他已彻底击败了癌细胞。
基因疗法对帕金森氏病的治疗:
帕金森氏病又称震颤麻痹,是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病,主要症状是手指及四肢颤动、振摇,同时肢体某一部分或全部肢体不能自主运动(麻痹)。
患者一般在50-65岁开始发病,发病率随年龄增长而逐渐增加,60岁发病率约为1‰,70岁发病率达3‰~5‰,仅在我国目前就有约170多万人患此病。
目前无根治方法可以使变性的神经细胞恢复。
目前认为帕金森氏病的病因是神经细胞的退行性变化,主要病变部位在大脑的黑质和纹状体。
纹状体得名于其多纹的外形,来自于大量致密的纹状体-苍白球-黑质(纹苍黑)纤维,也就是基底核。
基底核的黑质细胞数量逐渐减少、功能逐步丧失,会使大脑的一种神经介质多巴胺减少,从而引起震颤麻痹。
同时,根据动物实验和流行病学的调查,也提示帕金森氏病与遗传有一定的关系。
对于这种目前暂无方法治疗的疾病就可以用基因疗法来试验治疗。
2007年6月,美国康奈尔大学韦尔医学院的卡普里特等人对12例帕金森病(PD)患者进行了Ⅰ期临床试验治疗。
结果表明,以腺相关病毒(AAV)作为载体将谷氨酸脱羧酶(GAD)基因导入基底核,治疗帕金森病安全性良好。
治疗3个月后,患者运动功能改善25%~30%。
GAD可催化γ-氨基丁酸(GABA)的合成,后者发挥对运动神经的抑制功能。
在PD患者中,黑质细胞产生GABA的能力下降,造成运动功能控制乏力。
该试验有12例患者,其中男性11例、女性1例,平均年龄58.2岁。
患者每4例1组,共分3组,分别接受小剂量、中等剂量和大剂量的AAVGAD注射。
研究者临床评价了患者在基线、注射后1、3、6和12个月时的服药情况,随访1年。
评价该基因疗法的有效性采用帕金森病评分量表(UPDRS)、日常活动量表(ADL)、神经心理学测试和18F-脱氧葡萄糖正电子发射体层摄影(PET)等方法。
所有患者没有发现与基因疗法相关的不良反应。
患者的运动UPDRS评分有显著改善,尤其是与患者未接受治疗的一侧相对比。
患者UPDRS评分改善在治疗后3个月开始,改善程度达25%~30%,改善一直持续到治疗后第12个月,一些患者运动功能改善程度可达40%~65%。
PET扫描结果表明,在接受治疗的半脑中丘脑代谢活性有显著下降,与接受DBS手术者相似。
而DBS是脑深部慢性电刺激,即脑起搏器治疗,于20世纪末开始应用于临床,是目前世界上较好的治疗PD的方法,能克服毁损手术的缺点,副作用少,不破坏脑的神经核团。
而基因疗法试验治疗后,患者临床运动评分改善与大脑辅助运动区代谢增加高度相关。
在基因治疗后的1年内,没有发现不良反应,初步证实了AAV载GAD基因疗法的安全性。
基因疗法对艾滋病的治疗:
人类首个艾滋病病毒(HIV)感染患者的基因治疗临床试验结果终于出来了。
新成果发表在日前在线出版的《自然—医学》期刊上。
对艾滋病患者来说,基因治疗是一种颇有吸引力的选择,因为这种疗法的一次性使用就可减少病毒数量、保护免疫系统和避免抗逆转录治疗的终身使用。
RonaldMitsuyasu和同事对74位HIV成人感染者实施了随机、双盲、安慰剂控制的基因转换临床试验,受试者或者是接受安慰剂,或者接受携带有名为OZ1分子的血液干细胞,这种子以2种HIV蛋白质为靶标从而预防了病毒的复制。
在整个临床试验过程中,OZ1是安全的,没有产生任何副作用。
尽管在47周和48周的试验中,接受OZ1和安慰剂的2组受试者在病毒数量上没有统计学上的区别,但在100周时,OZ1组的CD4+淋巴细胞数量要高一些,而在患者体内,这种淋巴细胞被HIV去除了。
新研究显示,对HIV感染者实施基因治疗是安全有效的,而且这种治疗方法可发展为对付艾滋病的通用方法。
基因疗法对脑部疾病的治疗:
迄今,大脑仍是多数外科手术的禁区,而且由于血脑屏障的阻碍,许多药物难以到达大脑中形成有效的治疗效果,因而药物也难以治愈许多大脑疾病。
基因疗法的出现为治疗大脑疾病带来了全新希望。
这种疗法的根本优势在于既能保证大脑的安全,又能迅速有效地治愈大脑病变。
去年11月5日《科学》杂志发表的一项研究显示,研究者运用修饰过的HIV病毒治疗了两名患有破坏性脑疾病———脑白质肾上腺萎缩症(ALD)的男孩。
在治疗过程中,HIV病毒携带了一个具有治疗作用的基因,这标志着人类首次运用基因疗法治疗与X染色体有关的致死性疾病———ALD。
基因疗法对心脏病的治疗:
英国研究人员发明了一种治疗心脏病的基因疗法。
这种疗法的原理是:
以一种经过转基因技术改造的腺相关病毒为载体,将SERCA2A基因注入心脏病患者的心肌细胞中。
SERCA2A基因可使心肌收缩更有力。
研究人员说,这种疗法可使受损心脏组织周围的健康心肌搏动速度加快,并且更有力,有助于修补受损心脏,使心脏恢复原有的大部分功能,从而让一些严重的心脏病患者免受心脏移植手术带来的痛苦。
基因疗法临床试验所涉及的数据
虽然越来越多的报道表明,基因疗法正逐渐的发展,而且能够利用基因疗法进行治疗的疾病也越来越多,但是,对于基因疗法所存在的问题以及一些技术难题,我们不得不面对。
随着基因疗法成功的报道不断涌现,斯坦福大学医学院的人类基因疗法计划主任、美国基因和细胞疗法学会创始人之一的马克·凯(Mark·Kay)认为:
“基因治疗还必须克服以下四个技术障碍。
”
1.首先,必不可少的是要让载体到达足够高的数量水平的特定细胞中,以产生所需的响应,但没有毒性问题。
2.一旦携带有编码基因的载体到达所需细胞,载体就必须被内化并到达细胞核,但细胞已天然设置了许多屏障来阻止新导入的DNA与现有的DNA相互作用。
不过病毒是良好的运载工具,因为它们已发展出了穿过这些障碍的机制。
现已证明,克服这个困难要比以前预料的更加艰难。
3.一旦进入了细胞核,这个新导入的基因必须能够坚持存在一段时间,至少要达到所需时间长度。
细胞有时能切断新基因,使其失效。
4.最后一个主要问题就是潜在的免疫反应。
如果这个基因产物被认为是一个外来物,那么人体就会对这个载体或蛋白质发动攻击。
另一个普遍的问题是确定基因疗法应该持续多长时间。
如果你在治疗一种传染病或癌症,只需要让基因疗法持续到这种传染病或癌症被消除即可。
但如果是遗传病,你需要终生的基因修正。
随着基因疗法的发展,也带出了很多的安全隐患和伦理道德问题。
人们总是小心翼翼地前行,对于一些基因治疗可能会存在着什么风险,我们也不确切地知道。
从日益增加的证据表明,白血病患者可能有一种不同寻常的疾病特异性问题[两名患X-连锁重症联合免疫缺陷病(XSCID)的儿童,1998年采用基因疗法成功治愈,当时引起了高度关注,这两名儿童后来患上了白血病。
任何时候你向细胞中插入新的DNA,都将有一些风险,即增加患恶性肿瘤的机率。
目前有很多跟基因疗法无关的治疗手段,其罹患癌症的风险也比较高。
例如,在治疗一种类型的癌症中,你可能使用了增加罹患另一种癌症风险的分子。
当我们继续深入基因疗法的未知领域时,关注其毒性和更长期的副作用将是首要的。
基因疗法的发展激起了大量的道德争议,争论的焦点在于是否能将实验扩展到胚胎和胎儿细胞以及生殖细胞。
有些致命的和致终生残疾的单基因突变遗传病,在出生之前或出生后不久就表现出症状,例如囊性纤维病变。
这一类疾病的治疗在胎儿期远比在儿童期有效。
在基因剔除的转基因小鼠模型中使用inutero疗法治疗相应疾病已取得满意疗效。
人类的inutero和生殖细胞基因疗法在几年内仍将被禁止。
马克·凯说:
“未来在治疗疾病的过程中,我们不得不决定在哪里划清分界线时,更大的伦理问题很可能会出现。
显然,基因疗法应该被用于严重的精神障碍或遗传病,但是要决定它是否可用于治疗神经行为障碍,如抑郁症或成瘾性疾病,这更多的是灰色地带。
还有,我们应该使用基因疗法来增强或选择某些特征(如较高的智商或运动能力)吗?
尽管现在还不可能治疗上述疾病中的任一种,不过随着基因疗法取得更大的进步,将来人们可能会开始问这些问题的。
”
分析人士指出,任何新疗法诞生的过程中意外事件是不可避免的,或许是因为基因疗法走在时代的最前列,所以受到了格外的关注。
科学界必须从意外事件中吸取教训,恰当地处理这类事故,研究更好的疗法。
政府管理机构和普通公众也应当公允地看待这类事故,一方面对这些研究予以更多关注与监督,另一方面也要认识到科学发展过程绝非一帆风顺,而是靠科学本身的自我纠错机制在不断前进,不能因噎废食给科研施加过多的压力。
目前,有关科学家正寻求同行合作,采用新技术追踪携带治疗基因的逆转录病毒插入人体染色体的位置,试图更深入、准确地评估此疗法诱发癌症的危险有多大。
另一些科学家则致力于改进疗法,例如给病毒载体装备上自杀基因,一旦发现它导致人体细胞异常增生就立即用药物控制,将癌症扼杀在萌芽状态。
还有人设法减少病毒载体与人体DNA的作用,或采用更安全的新型病毒来充当载体。
据信,随着研究的深入和基因治疗的不断完善,那些已出现或潜在的问题会逐渐解决。
正如基因治疗专家们所说,再给科学一次机会,加上科学界的共同努力、公众的理解和支持,基因疗法依然前景无限。
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