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石冬敏专题报告材料血小板聚集率测定
血小板聚集率测定标准化操作及临床应用
石冬敏
医科大学附属市立医院本部(215002)
关键词:
血小板聚集率;标准化;诱导剂;血栓;
血管壁受损、血小板活化导致血小板粘附聚集和释放反应增强是许多疾病中血栓形成的重要条件,使用抑制血小板功能的药物已成为预防和治疗血栓性疾病的常规疗法[1]。
近年血小板聚集率测定在疾病的诊断治疗和用药监测的作用受到重视[2]。
本文从血小板聚集率测定及标准化操作和临床应用三方面进行阐述,并着重讨论血小板聚集率测定在老年动脉粥样硬化的应用。
一、血小板功能检测
最早的检测血小板功能的方法是出血时间。
它操作简单快速,但受技术人员的操作技术,皮肤厚度和温度的影响。
且这一方法“在血小板减少的患者测定血小板功能的缺陷时作用有限”。
[3]已淘汰。
现有的血小板功能试验包括血小板粘附试验、血小板聚集试验(PAgT)、血浆血小板球蛋白和血小板因子4测定、P-选择素测定、血小板因子3有效性测定、血块收缩试验、血栓烷B2(TXB2)检测、11-脱氢-血栓烷B2(11-DH-TXB2)、血小板环核苷酸测定、血小板钙流的测定、5-羟色胺的测定、血小板凝血酶敏感蛋白测定、血浆纤维连接蛋白测定、血小板膜糖蛋白测定、同种血小板抗体的检测[4]。
目前评价血小板功能最常用的方法是PAgT。
二、PAgT和诱导剂
PAgT包括第一相聚集与第二相聚集,血小板与外源性诱导剂接触后即发生聚集称第一相聚集,亦称初级聚集,指加入诱导剂1分钟的血小板聚集率——PAG
(1),它与GPⅡb/Ⅲa和Fg的相互反应有关,如GPⅡb/Ⅲa或/和Fg有缺陷,第一相聚集减低。
第一相聚集诱导血小板活化,血小板结构发生变化,释放出ADP等源性致聚剂,加剧血小板聚集,称为第二相聚集,又称次级聚集,指加入诱导剂3分钟的血小板聚集率——PAG(3),如血小板释放反应有缺陷,第二相聚集减低。
血小板聚集诱导剂有:
二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、肾上腺素、胶原、凝血酶、瑞斯托霉素和前列腺过氧化物。
不同的血小板诱导剂对血小板的作用有所不同。
弱活化剂ADP只能引起较微弱的释放反应,依赖于第一相聚集的跨膜信息传递活化血小板,导致第二相聚集。
当ADP为0.3mol/L时,仅有初发聚集波(第一聚集波);当ADP为0.5umol时,可出现双相聚集波(第二聚集波);ADP>1.0umol时,有一个不可逆转的单相波形,即血小板聚集试验5分钟产生的聚集曲线[5,6]。
凡是促进血小板中的cAMP减少的物质如ADP、AA、肾上腺素、凝血酶、5-HT、PGG2、PGH2等,都可诱导血小板的聚集;反之,凡是可以使血小板中的cAMP增加的物质如α肾上腺素能阻滞剂、β肾上腺素能兴奋剂、PGE1、PGD2、PGI2、腺苷、咖啡因、氨茶碱、潘生丁等,都可抑制血小板的聚集。
三、PAgT原理和测定
血小板聚集检测可分为光学法(PRP比浊法)、阻抗法、血液灌注压法、发色底物/发光物-聚集剂法、非离心式聚集阈值测定法和切变诱导血小板聚集法。
不同的测定方法与PRP聚集测定结果相关性不同[7]。
光学法又分为透射比浊法和散射比浊法,本文重点阐述常用的透射比浊法。
1、原理:
在磁力搅拌条件下,在PRP中加入诱导剂,血小板发生聚集,悬液浊度随之下降,透光度增加,据透光度变化曲线计算血小板聚集率[8]。
2、方法:
静脉采血,与枸橼酸钠抗凝剂9:
1在硅化管混匀。
样本低速离心(1000rpm)5分钟,取上层富含血小板血浆(PRP)置37℃预温。
PRP中血小板计数应当标准化,以250-300×109/L为宜。
可通过加入贫血小板血浆调整。
样本再以3000rpm离心10分钟,制备贫血小板血浆(PPP)作为空白对照。
将小磁珠放入含有PRP的比色皿中,在聚集仪中磁珠以1100rpm转动,加入诱导剂,记录透光度变化曲线。
四、PAgT实验标准化操作
PAgT影响因素多,结果变异大,调查表明操作者变异、批变异和天间变异约围15-56%[9,10]。
因此,标准化操作十分必要。
主要因素有:
1、药物:
阿司匹林,潘生丁,肝素,双香豆素等均可抑制血小板聚集。
阿司匹林抑制血小板聚集作用可持续1周,故采血前1周不应服用此类药物[11]。
2、采血:
静脉采血,避免反复穿刺或气泡混入。
组织液可使少量凝血酶形成引起血小板聚集。
应使用109mmol/L枸橼酸钠厚壁双倍硅化壁(无死腔)真空采血管,因为“死腔”可激活血小板,使血小板第4因子提前消耗,PAgT降低。
有的抗凝管加入潘生丁等药物,可抑制血小板聚集[12,13]。
3、抗凝剂:
使用单一的枸橼酸钠抗凝剂,血与抗凝剂9:
1为宜,血小板聚集作用随血浆中枸橼酸钠浓度的降低而增高。
忌用EDTA作为抗凝剂,EDTA由于螯合Ca2+作用强,使ADP不能引起血小板聚集[14]。
4、时间:
制取PRP后30分钟不应进行测定,因此时血小板反应性差。
但整个测定须在2小时完成[15,16]。
5、诱导剂:
ADP在保存中会自行分解产生AMP,所以配制成溶液后宜在-20℃冰箱中贮存。
一般半年活性不会降低。
AA性质不稳定性,配制贮存运输过程均要求-20℃。
应用肾上腺素时,应裹以黑纸避光,以减少分解。
6、比浊法测定PAgT时,比色皿应选择水晶材质,经常清洗,防止蛋白和色素沉积,造成透光度下降。
我们用COULTERCLENZTM清洗液浸泡后蒸馏水冲洗效果较好[17]。
7、测定操作:
PRP不可混入红细胞,测定量200ul为宜,磁珠直径不可小,否则均可致结果偏低。
五、PAgT的临床应用
PAgT无需昂贵的仪器和特殊的试剂盒,便于基层实验室开展,操作简单,半小时即可得出结果,适用于临床诊断,特别是某些急症患者。
临床应用有以下3方面:
1、血小板聚集功能亢进能敏感的发现血栓前状态。
当血液处于高凝状态,如伴有血管受损或血流缓慢则称为血栓前状态。
它易导致血栓栓塞形成或加重栓塞的病理过程的发生和发展,引起一系列的疾病。
见于DIC早期、高凝状态和血栓性疾病,如急性心肌梗塞、心绞痛、糖尿病伴血管病变、脑血管病变、高β-脂蛋白血症等。
PAgT增高,可以为上述疾病的诊断和治疗提供依据,针对病因进行治疗。
2、血小板聚集率是出血性疾病诊断的常用指标。
如GPⅡb/Ⅲa或/和Fg有缺陷,PAG
(1)减低,如血小板释放反应有缺陷,PAG(3)减低。
可初步筛检血小板无力症、巨大血小板综合症、贮存池病及纤维蛋白血症、尿毒症、肝硬变、Wilson病、维生素B12缺乏症和感染性心膜炎等。
3、不同诱导剂的血小板最大聚集率(MAR)测定对临床用药的监测作用是血栓与止血研究课题。
肠溶阿司匹林廉价,广泛运用于冠心病的一、二级预防。
国际抗血栓联合组的65个临床试验发现,应用阿司匹林(ASA)可减少各类栓塞和血栓事件约23%[18]。
抗血小板聚集实验者协会分析了超过10万例治疗者的资料,表明ASA能使心肌梗死和脑卒中的发生率降低25%,血管移植、动脉栓塞发生率减少48%,肺栓塞发生率减少67%,深静脉血栓发生率减少23%[19]。
但仍有部分患者没有抗血栓效应而发生心脑血管血栓事件,这种现象称为阿司匹林抵抗(aspirinresistance,AR)[20]。
氯吡格雷安全性与ASA类似,价格略贵,一般用于AR患者[21]。
两种药物的差别在于药理机制不同,ASA的抗血小板作用在于抑制细胞环氧化酶,ASA使血小板花生四烯酸代谢途径的环氧化酶活性基因第529位丝氨酸乙酰化后失去活性,从而抑制血栓烷A2(TXA2)的生成。
ASA是不可逆的,口服单剂量的ASA的抗血小板作用可持续7d,接近血小板的平均生存期(9-10d),直至骨髓产生新的血小板。
研究表明,小剂量ASA对血小板环氧化酶有明显抑制作用,对皮细胞环氧化酶抑制作用弱,因为皮细胞有再生环氧化酶能力。
ASA同时可抑制血管皮细胞前列环素(PGI2),此点尚有争论[34]。
氯吡格雷是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物,能选择性的与血小板表面腺苷酸环化酶偶联的ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集。
抑制ADP诱导的MAR作用在3~7天达到稳态。
稳态时对血小板的平均抑制水平维持在40~60%[22]。
由于ASA减少AA代谢生成血栓素,阻断了AA代谢途径,因此对AA诱导的MAR的抑制更显著。
氯吡格雷由于能直接抑制血小板表面的ADP受体,因此对ADP诱导的MAR抑制显著。
单以MAR很难判断氯吡格雷和阿司匹林哪个抗血小板作用更强,国外的大型临床试验通过对心血管事件的发生率的长期观察更科学可信[23]。
2种药物最严重的副作用是出血。
MAR测定可能是确定药物个体化用量的途径,氯吡格雷监测以ADP诱导MAR为佳,阿司匹林调整理想剂量的指标应重视AA诱导的MAR。
该测定可能是监测阿司匹林抵抗和出血的最佳途径,当阿司匹林将AA完全阻断,此时可能出现AA诱导MAR低于5%,而ADP诱导MAR仍在40%左右,阿司匹林抵抗和出血可能产生,当深入研究。
六、PAgT在老年动脉粥样硬化的应用
阿司匹林肠溶片因用药不当诱发出血并不鲜见。
氯吡格雷是一种新型抑制血小板药物,多用于阿司匹林抵抗患者,该类患者约占接受阿司匹林治疗者的10%,且多为高龄老干部[24、25]。
不同诱导剂的血小板最大聚集率(MAR)测定常用于安全用药监测,亟待自动凝血分析仪应用开发。
我们实验分析对比老年动脉粥样硬化患者应用氯吡格雷和阿司匹林治疗前后的花生四烯酸(AA)和二磷酸腺苷(ADP)诱导的MAR。
报告如下:
(一)材料与方法
1、临床资料2005年2月~2007年2月住院的稳定状态的动脉粥样硬化症患者79例,年龄72~90岁,平均77.8.1±3.9岁,男性60例,女性19例。
均为《国际动脉粥样硬化学会预防动脉粥样硬化性心血管疾病综合指南》所确定的高危人群[26],具有以下任何一项诊断者:
1、稳定型心绞痛或冠脉支架安置术后;2、彩色超声提示颈动脉斑块或曾有脑梗塞病史或短暂性脑缺血病史者;3、彩色超声提示下肢动脉粥样斑块形成。
排除标准:
急性血栓形成(冠脉综合症、脑卒中急性期);高血压未能很好控制;机械性人工瓣膜和服华法林抗凝者;严重肝肾功能不全;临床明确的血小板减少症或中性粒细胞减少症及严重感染。
入选者随机分成氯吡格雷组27例,阿司匹林组26例,对照组26例。
各组临床资料见表1。
MAR测定实验室正常对照为40例健康体检者,年龄45.7±11.6岁,男/女比例1.0。
表1不同治疗组临床资料及疾病分布
n=79
氯吡格雷组
阿司匹林组
对照组
例数
27
26
26
年龄(岁)
78.7±4.2
77.5±4.1
77.3±3.3
男/女
21/6
19/7
20/6
动脉粥样硬化:
冠心病
3
7
4
颈动脉斑块
11
8
9
下肢动脉斑块
1
1
0
脑梗塞、短暂性脑
缺血12
10
13
合并症:
蛋白尿
5
3
4
高血压
14
13
14
2型糖尿病
7
6
6
慢性心衰
2
3
2
动脉粥样硬化疾病组成:
X2=2.831,P=0.586;合并症疾病组成:
X2=0.770,P=0.993
2、方法临床实验为随机、平行研究。
均针对原发病治疗,避免使用抗凝剂和其它抗血小板药物。
氯吡格雷组早餐后口服波利维(赛诺非-德拉堡公司产品,批号:
1949,每片75mg)75mg.d-1,7天;阿司匹林组早餐后口服阿司匹林肠溶片(永宁制药公司产品,批号:
061102,每片25mg)100mg.d-1,7天;总疗程2周,包括1周安慰剂清洗期和1周药物治疗期;对照组未使用任何抗血小板药物。
均在治疗前后用109mmol/L枸橼酸钠小容量(2.7ml)厚壁双倍硅化壁真空采血管(无死腔)晨空腹采血,立即用透射比浊法测定AA和ADP诱导的MAR[27]。
3、仪器与试剂:
抗凝管由BD公司生
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