制药化工生医专业生化实验指导书.docx
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制药化工生医专业生化实验指导书
《生物化学》实验指导书
适用专业:
制药工程、化工工程、生物医学
生物与食品工程学院生物科学系
生物化学实验细则
为了保证生物化学实验的顺利进行,培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能,特制定以下实验细则,请同学们严格遵守。
1.实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。
2.严格按照生物化学实验分组,分批进入实验室,不得迟到。
非本实验组的同学不准进入实验室。
3.进入实验室必须穿实验服。
各位同学进入各自实验小组实验台后,保持安静,不得大声喧哗和嬉戏,不得无故离开本实验台随便走动。
绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。
4.实验中应保持实验台的整洁,废液倒入废液桶中,用过的滤纸放入垃圾桶中,禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。
5.实验中要注意节约药品与试剂,爱护仪器,使用前应了解使用方法,使用时要严格遵守操作规程,不得擅自移动实验仪器。
否则,因非实验性损坏,由损坏者赔还。
6.使用水、火、电时,要做到人在使用,人走关水、断电、熄火。
7.做完实验要清洗仪器、器皿,并放回原位,擦净桌面。
8.实验后,要及时完成实验报告。
实验一蛋白质的沉淀、变性反应
(4学时)
目的要求
1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。
原理
在水溶液中,蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒,所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。
但是,蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的,相对的。
在一定的物理化学因素影响下,蛋白质颗粒失去电荷,脱水,甚至变性,则以固态形式从溶液中析出,这个过程称为蛋白质的沉淀反应。
这种反应可分为以下两种类型:
1.可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时,蛋白质虽已沉淀析出,但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化,基本上保持原有的性质,沉淀因素除去后,能再溶于原来的溶剂中。
这种作用称为可逆沉淀反应。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀,提纯蛋白质时,常利用此类反应。
2.不可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时,蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏,失去原来的天然性质,这时蛋白质已发生变性。
这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂,强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)并不析出,因此,变性蛋白质不一定都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
试剂和器材
一、试剂
1.蛋白质溶液:
10ml/组
取5ml鸡或鸭蛋清,用蒸馏水稀释至100ml,搅拌均匀后用4—8层纱布过滤,新鲜配置。
2.蛋白质氯化钠溶液:
3ml/组
取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml,充分搅匀后,以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。
3.其余试剂:
硫酸铵粉末(10克/组),饱和硫酸铵溶液(150ml),3%硝酸银(280ml),0.5%乙酸铅(200ml),浓硫酸(5ml/组),5%磺基水杨酸(100ml),0.1%硫酸铜(100ml),饱和硫酸铜溶液(400ml),0.1%乙酸(500ml),10%乙酸(500ml),饱和氯化钠溶液(25ml),10%氢氧化钠溶液(500ml)。
二、器材
试管(15支/组),过滤漏斗(1个),试管架1个/组,玻璃棒1支/组,沸水浴4台,量筒(总需要20ml×1,200ml×1),烧杯(总需要100ml×2,400×2),试剂瓶(12个/组,附胶头滴管10支/组),移液管(5ml×6/组,1ml×3/组),滤纸1盒,洗瓶1个/组,废液缸1个/组,药匙1个/组,移液管架1个/组
操作方法
一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析)
二、蛋白质的不可逆沉淀反应
1.重金属沉淀蛋白质
2.酸沉淀蛋白质
1)
2)
3.加热沉淀蛋白质
取5支试管,编号,按下表加入有关试剂(单位/滴)。
蛋白质溶液
0.1%乙酸
10%乙酸
饱和氯化钠
10%氢氧化钠
蒸馏水
1
2
3
4
5
10
10
10
10
10
—
5
—
—
—
—
—
5
5
—
—
—
—
2
—
—
—
—
—
2
7
2
2
—
5
将各管混匀,观察记录各管现象后,放入沸水浴中加热10min,比较各管的沉淀情况。
思考题
1.名词解释:
水化层;双电层;蛋白质变性;盐溶与盐析;蛋白质等电点沉淀。
2.将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。
3.根据实验现象,讨论下列问题:
1)蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么?
2)简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。
4.作为杀菌剂,氯化汞是怎样起作用的?
实验二唾液淀粉酶的性质测定
(4学时)
目的要求
1.了解酶的专一性,掌握检查酶的专一性的原理及方法。
2.了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响,学习检查激活剂和抑制剂影响酶促反应速度的方法。
3.了解pH对酶活性的影响以及最适pH的含义,学习测定酶最适pH的方法。
4.了解温度对酶活性的影响以及最适温度的含义,学习测定酶最适温度的方法。
原理
一、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
在酶促反应中,酶的激活剂或抑制剂可分别加速或抑制酶的活性,如氯化钠在低浓度时为唾液淀粉酶的激活剂,而硫酸铜则是它的抑制剂。
本实验利用水解不同阶段淀粉与KI—I2有不同的颜色反应,定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。
淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段与碘作用的颜色反应如下:
二、pH对酶活性的影响
酶的催化活性与环境pH有密切关系,通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性,酶活性最高时的pH,称为酶的最适pH。
高于或低于此pH时酶的活性逐渐降低。
不同的酶最适pH不同,对于同一个酶,其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
如唾液淀粉酶在磷酸缓冲液中最适pH为6.4—6.6,而在乙酸缓冲液中则为5.6。
三、温度对酶活性的影响
酶促反应开始时,反应速度随温度升高而增快。
达到最大反应速度时的温度称为酶的最适温度。
由于绝大多数酶是有活性的蛋白质,当达到最适温度后继续升高温度,引起蛋白质变性,酶促反应速度反而下降。
本实验利用唾液淀粉酶在不同温度下催化淀粉水解,水解产物与KI—I2显色的深浅,可判别水解程度。
试剂和器材
一、试剂
1.新鲜唾液稀释液:
每组同学进实验室后自己制备。
唾液1ml(不包括泡沫),用蒸馏水稀释至100ml,棉花过滤备用。
唾液稀释倍数因人而异,可稀释100—400倍。
3.碘化钾—碘液:
5ml/组共100ml
取碘化钾20g和碘10g溶于100ml蒸馏水中,使用前稀释10倍。
4.缓冲溶液:
各种缓冲液共配制200ml
用0.2mol/L磷酸氢二纳溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液配制pH5.0,5.4,6.0,6.4,6.8,7.4,8.0的缓冲溶液。
称取Na2HPO4·2H2O35.61克,用蒸馏水定容至1000ml;另称取C6H8O7·H2O21.01克,用蒸馏水定容至1000ml。
根据下表配制缓冲液:
(单位/ml)
pH
0.2mol/LNa2HPO4溶液
0.2mol/LC6H8O7溶液
5.0
103.0
97.0
6.0
126.3
73.7
6.8
154.5
45.5
7.4
181.7
18.3
8.0
194.5
5.5
5其余试剂
0.1%淀粉溶液500ml,1%氯化钠溶液200ml,0.1%硫酸铜溶液200ml,0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液1500ml,
二、器材
试管(22支/组),试管架1个/组,玻璃棒1支/组,水浴(37℃水浴,60℃水浴),酒精灯(及火柴)1个/组,量筒(100ml×1个,10ml×1个),烧杯(100ml×3个/组),胶头滴管(1支/组),试管夹1个/组,点滴板1个/组,移液管(1ml×5/组,2ml×3/组,5ml×10/组),试剂瓶(14个/组,附胶头滴管),洗瓶1个/组,大烧杯1个/组,棉花,冰块,移液管架1个/组
操作方法
一、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响
取3支试管,编号,按下表操作:
1
2
3
4
5
唾液稀释液/ml
1
1
1
—
—
0.1%淀粉溶液/ml
3
3
3
3
—
1%NaCl/ml
1
—
—
—
—
0.1%CuSO4/ml
—
1
—
—
—
蒸馏水/ml
—
—
1
2
5
摇匀置37℃水浴保温15min,取出冷却后
KI—I2(滴)
1
1
1
1
1
观察颜色反应
二、pH对酶活性的影响
1.找出本实验准确的保温时间
保温时间是指从加入酶液开始到从水浴中取出试管加入一滴KI—I2的时间。
摸准保温时间是实验的关键。
方法如下:
2.观察pH对酶活力的影响
取5支试管,编号,按下表操作,保温时间参考操作1。
1
2
3
4
5
pH值
5.0
6.0
6.8
7.4
8.0
0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液/ml
2
2
2
2
2
相应pH值缓冲液
3
3
3
3
3
每隔1min逐管加入稀释酶液/ml
2
2
2
2
2
摇匀,置37℃水浴,至保温时间后,每隔1min依次取出
立即加KI—I2(滴),充分摇匀
1
1
1
1
1
记录结果
从各管呈现的颜色,判断不同pH对淀粉酶活性的影响,并确定其最适pH。
三、温度对酶活力的影响
取试管4支,编号,按下表操作:
1
2
3
4
0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液/ml
2
2
2
2
温度
室温
37℃
60℃
火上加热
保温5min
每隔1min逐管加入稀释酶液/ml
2
2
2
2
摇匀,各温度下保温20min,每隔1min依次取出
立即加KI—I2(/滴),充分摇匀
1
1
1
1
记录结果
从各管呈现的颜色,判断不同温度对淀粉酶活性的影响。
思考题
1.分析酶的底物、pH、温度、激活剂和抑制剂影响酶活性的原因。
实验三唾液淀粉酶的活力测定
(4学时)
实验目的
1.学习酶活力,酶活力单位,比活力的测定,加深对概念的理解;
2.学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,学会用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的含量,熟练操作分光光度计。
实验试剂和器材
一、试剂
可溶性淀粉,NaoH,标准牛血清白蛋白,蒸馏水,95%乙醇,85%磷,0.15molNaCL/ml,0.15mol/L硫酸铜溶液,
(1)考马斯亮蓝试剂G-250:
考马斯亮蓝试剂G-250100mg溶于50ml95%乙醇中,加入100ml85%磷酸,加水稀释至1000ml,过滤即可。
:
(2)3,5-二硝基水杨酸:
以称取3,5-二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21.0g充分溶解于500ml蒸馏水中(水先煮沸10分钟后冷却),加入酒石酸钾钠182.0g,苯酚(在50℃水中融化)5.0ml,偏重亚硫酸钠5.0g,搅拌至全溶,定容至1000ml。
充分溶解后盛于棕色瓶中,放置10天后便可使用。
平时盛一小瓶放在外面使用,其它储于冰箱中。
此溶液每月配制一次。
注意:
DNS一定要在配制结束后立即转移到小棕色瓶中,同时,使用过程中尽量减少与空气接触。
(3)标准牛血清白蛋白溶液:
结晶牛血清白蛋白用0.15mol/LNaCl配置成0.1mg/mL的蛋白液
(4)0.1%葡萄糖:
准确称取100mg葡萄糖,溶于蒸馏水中,定容于100ml的容量瓶中,配成1.0mg/L的溶液。
二、器材
可见光分光光度计,试管,移液管,恒温水浴锅,pH试纸,1000ml容量瓶和100ml的容量瓶各一只
操作方法
一、酶活力的测定
1)葡萄糖标准曲线的制定
取8支试管编号后,按下表顺序向各管中加入0.1%葡萄糖标准溶液和蒸馏水,配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。
然后向各管中加入3,5-二硝基水杨酸(DNS试剂)1.5毫升,混匀,放入沸水浴加热5min,迅速取出用自来水冷却至室温,在向每管加入蒸馏水稀释至25毫升,充分混匀。
在分光光度计上与540nm处测吸光度;以葡萄糖含量为横坐标,OD540nm值为纵坐标,绘制标准曲线。
表如下:
试剂处理试管编号
0
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液/ml
—
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
蒸馏水/ml
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
3,5-二硝基水杨酸/ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
λ=540nm的吸光值(A)
2)取2支试管,分别加入2ml稀释的酶液,其中1支为空白对照管,先加入0.5ml1mol/LNaOH溶液,混匀,使酶失活。
另一支加入2ml1%淀粉,迅速混匀,反应保温时间t后(实验二中操作步骤二
(1))沸水浴加热5min,终止反应。
然后按葡萄糖标准曲线制作方法同样操作,用3,5-二硝基水杨酸试剂测定酶促反应后所生成的还原糖量,由葡萄糖标准曲线求出酶活力单位数。
3)蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝染色法)
取十只试管,编号,按下表加样操作(单位/ml)
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.1mg/ml标准蛋白质溶液
---
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
---
---
---
稀释的酶液
---
---
---
---
---
---
0.1
0.3
0.5
0.15mol/LNaCl
1.0
0.9
0.7
0.5
0.3
0.1
0.9
0.7
0.5
考马斯亮蓝试剂
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
以0号为对照,在595nm比色A595nm
4)用标准蛋白质质量为横坐标,吸光度为纵坐标做标准曲线
5)计算酶活力和酶比活力;
实验四植物体内的转氨基作用
(4学时)
目的要求
1.掌握转氨基作用的特点,了解转氨酶的作用;
2.学习纸层析基本技术。
原理
植物体内通过转氨酶的作用,α-氨基酸上氨基可转移到α-酮酸原来酮基的位置上,结果形成一种新的α-酮酸和一种新的α-氨基酸,所生成的氨基酸可用纸上层析法检出。
试剂和器材
一、试剂
绿豆芽子叶及胚轴,0.1mol/L丙氨酸溶液,0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液(用NaOH中和至pH7),含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0),磷酸缓冲液(pH7.5),正丁醇,甲酸,0.1mol/L谷氨酸溶液,0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液。
二、器材
研钵,10ml量筒,离心机,试管,移液管,恒温箱,漏斗,层析缸,层析纸,毛细管,吹风机。
操作方法
一、酶液的提取
取发芽2~3天的绿豆芽5g,放入研钵中,加2ml磷酸缓冲液(pH8.0)研磨成匀浆,转入离心管。
研钵再用该1ml缓冲溶液冲洗,并入离心管中,以3000r/min的转速离心10min,取上清液备用。
二、酶促反应
取3支试管编号,按下表分别加入试剂和酶液(单位ml)
管号
0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液
0.1mol/L丙氨酸溶液
酶液
磷酸缓冲液(pH7.5)
1
0.5
0.5
0.5
1.5
2
0.5
—
0.5
2.0
3
—
0.5
0.5
2.0
将试管摇匀后置于37℃恒温箱中保温30min。
取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液终止酶反应,于沸水浴中加热10min,使蛋白质完全沉淀,冷却后离心或过滤,取上清液或滤液备用。
三、层析
取层析纸一张,在距底线2cm处用铅笔划一水平线,在线上等距离确定5个点,作为点样位置,相邻各点间距2.5cm。
取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液分别点样,反应液点5~6滴,标准液点2滴。
每点一次用吹风机吹干后再点下一次。
最后沿垂直于基线的方向将滤纸卷成圆筒,以线缝合,注意纸边不能叠在一起或接触。
在层析缸中放入正丁醇、甲酸、水推动剂的混合试剂(15:
3:
2)。
待缸内蒸气饱和后,将滤纸筒垂直放入,展层,待溶剂前沿上升至距滤纸前沿约2cm取出,用铅笔标出前沿位置。
吹干,剪断缝线,以0.1%~0.25%茚三酮丙酮溶液喷雾,置烘箱(60℃)内或用吹风机烘干后显色。
思考题
1.名词解释:
联合脱氨基作用;转氨基作用;氧化脱氨基作用
2.图示或张贴层析图,鉴定丙氨酸和α-酮戊二酸是否进行了转氨基作用,并写出相关的反应式。
3.实验操作过程中,为何不能用手接触滤纸?
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