提RNA逆转录qRTPCR步骤.docx
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提RNA逆转录qRTPCR步骤.docx
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提RNA逆转录qRTPCR步骤
【一、提RNA】
一、实验准备:
1、试剂:
75%乙醇、Trizol、1.5mL进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、
2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇),放-20℃冰箱预冷;
3、预冷离心机(1.5mLEP管用的);
4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;
二、操作步骤:
01、弃上清(不回收,直接倒去);
02、1mL/孔PBS洗两遍(不回收,直接倒去,随后用200μL枪吸尽PBS);
03、每孔加500μLTrizol,轻晃,随后室温放置2min左右;
04、枪头吹打,吸出放入1.5mL进口EP管;
05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol);
06、4℃离心机,12000g,15min;
07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL进口EP管中(注意:
只能吸到上清);
08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置10-30min(15min);
09、4℃离心机,12000g,10min;
10、倒掉液体,加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀;
11、4℃离心机,7500g,5min;
12、倒掉上清,加入1mL预冷的75%乙醇,混匀;
13、4℃离心机,7500g,5min;
14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;
15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水,吹打溶解;
16、测浓度(先知楼21楼测RNA浓度,带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头);
三、注意事项
01、如果当时不测RNA浓度,可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存,需要放在-80℃冰箱;
02、异丙醇作用是沉淀RNA,作用比乙醇好;
03、
04、
05、
06、
07、
08、
09、
【二、测RNA浓度】
一、实验准备:
01、先知楼21楼-2109教室,一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌ddH2O、10μL枪头(RNA专用)、本子+笔;
二、操作步骤:
01、登记;
02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleicacid”==>选择“OK”==>选择“RNA”;
03、灭菌ddH2O清洗2-3遍,擦干;
04、DEPC水校零:
即加DEPC水一滴,点击“Blank”,擦干;
05、测RNA:
加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;
06、记录数据,包括RNA浓度(<1000ng/μL)、260/280;
07、灭菌ddH2O清洗2-3遍,擦干;
08、-80℃冰箱保存;
三、注意事项
230nm代表有机物水平(碳水化合物),260nm代表RNA水平,280nm代表蛋白水平,260/230表示有机物量,260/280代表RNA提取量;
1.A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1-1.0。
如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。
DNA样品的A260吸光度值是否>0.1。
(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值<0.1);
2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:
纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。
如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。
3.A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:
纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。
A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。
在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。
4.A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。
该值应该接近0.0。
如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。
纯样品的A320一般是0。
5.A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值。
纯度好的DNA或RNA,在pH7-8.5下A260/A280的比值应该在2.0或2.5。
纯净的样品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。
如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
当0.5%BSA蛋白质污染时,蛋白污染会导致260和280的数值都下降,其净结果是260/280比值下降,但260/280的比值变化并不显著,正如分子克隆3所说。
但蛋白残留会导致230的数值显著上升,显著影响260/230的比值。
也就是说,如果RNA样品的260/280=1.7,260/230=0.5,那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留,而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时,用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。
原因是低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。
加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400ul左右。
6.当260/230<1时,只有两种情况。
一是胍盐污染,二是蛋白污染。
【三、逆转录】
一、实验准备:
01、进口10μL枪头(qRT-PCR专用)、冰盒一个、200μL进口EP管;
02、冰上融化1、2、4、2号试剂(提前半小时);
03、
二、操作步骤:
试剂盒:
1.2μL
2.0.5μL(最后加入)
3.0.5μL
4.0.5μL
RNA1000ng
DEPC水
----------------10μL体系
01、200μL进口管子:
EP管加相应DEPC水==>加1号试剂(2μL)==>加3号试剂(0.5μL)==>加4号试剂(0.5μL)==>加2号试剂(0.5μL)==>加RNA==>离心==>上机;
02、上机:
OPEN==>点击“User”菜单下的“clx”,点击“Accept”==>选择“run”下面的到“exp001rt”==>修改体系“10μL”(默认为25微升)==>点击“Start”,进入界面;
03、37.0℃15min==>85.0℃5s==>4.0℃60min;
04、4℃冰箱保存;
三、注意事项
01、加液尽量无气泡,枪不要打到底;
02、严格冰上操作,防止RNA降解;
【qRT-PCR】
一、实验准备:
01、试剂:
Roche的SyBrGreen(rox)
02、1.5mLEP管、0.2mLEP管、96孔板/八连冠;10μL、20μL、100μL、200μL、2.5μL、1000μL枪;
03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻(GAPDH)、cDNA、DEPC水;
二、操作步骤:
01、Rox10μL;
+ddH2O6μL;
+P1(F)1
+P2(R)1
+cDNA2
------------20μL体系
02、计算:
每个样,X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的),三个副孔。
即如果六个样,2个抗体(GAPDH,PLK1),三个副孔。
6*1*3=18≈20(PLK1),6*1*3=18≈20(GAPDH);
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
6/PLK1
6/PLK1
6/PLK1
5/PLK1
5/PLK1
5/PLK1
6/GAP
6/GAP
6/GAP
5/GAP
5/GAP
5/GAP
4/PLK1
4/PLK1
4/PLK1
3/PLK1
3/PLK1
3/PLK1
2/PLK1
2/PLK1
2/PLK1
1/PLK1
1/PLK1
1/PLK1
4/GAP
4/GAP
4/GAP
3/GAP
3/GAP
3/GAP
2/GAP
2/GAP
2/GAP
1/GAP
1/GAP
1/GAP
PLK1
Rox:
10*20=200μL
DEPC水:
6*20=120μL
F:
1*20=20μL
R:
1*20=20μL
GAPDH
Rox:
10*20=200μL
DEPC水:
6*20=120μL
F:
1*20=20μL
R:
1*20=20μL
03、稀释cDNA10倍(18μLDEPC水+2μL)==>配置Mix(Rox+DEPC水+F+R)==>加样(一横排先加18μLmix(GAPDH),随后加入18μLmix(PLK1)。
随后六个孔加同一个cDNA;
06、去除气泡:
加好样后,观察有无气泡。
如果有气泡,弹开,随后>2000rpm离心,时间不定(5s即可);
07、上机+设置程序:
A、双击打开程序“StepOneSoftwarev2.1”==>点击“OK”==>点击“Ignore&ContinueStartup”==>点击“AdvancedSetup”==>进入“ExpermentProperties界面”;
B、ExpermentProperties界面:
将ExprimentName从Untitled修改为“日期,如2015-12-17”,将UserName(Optional)修改为“CZL”;
Whichinstrumentareyouusingtoruntheexperiment?
中选择“96wells”,一般无需修改;
Whattypeofexperimentdoyouwanttosetup?
中选择“Quantitation-ComparativeCT(△△CT)”;
Whichreagentsdoyouwanttousetodetectthetargetsequence?
中选择“SYBRGreenReagents”;
Whichrampspeeddoyouwanttouseintheinstrumentrun?
中选择“Fast(~40minutestocompletearun)”;
C、PlateSetup界面-DefineTargetsandSamples界面:
DefineTargets栏中:
如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物,则点击“AddNewTarget”三下,出现“Target1、Target2、Target3、Target4”三个==>将其重命名;
DefineSamples栏中:
如果有6个样品(N;1.5;3;6;9;12),则点击“AddNewSample”,出现“Sample1、Sample2、Sample3、Sample4、Sample5、Sample6”六个==>将其重命名;
PlateSetup界面-AssignTargetsandSamples界面:
GAP/1
GAP/1
GAP/1
GAP/2
GAP/2
GAP/2
GAP/3
GAP/3
GAP/3
GAP/4
GAP/4
GAP/4
Plk1/1
Plk1/1
Plk1/1
Plk1/2
Plk1/2
Plk1/2
Plk1/3
Plk1/3
Plk1/3
Plk1/4
Plk1/4
Plk1/4
Akt/1
Akt/1
Akt/1
Akt/2
Akt/2
Akt/2
Akt/3
Akt/3
Akt/3
Akt/4
Akt/4
Akt/4
PI3K/1
PI3K/1
PI3K/1
PI3K/2
PI3K/2
PI3K/2
PI3K/3
PI3K/3
PI3K/3
PI3K/4
PI3K/4
PI3K/4
GAP/5
GAP/5
GAP/5
GAP/6
GAP/6
GAP/6
Plk1/5
Plk1/5
Plk1/5
Plk1/6
Plk1/6
Plk1/6
Akt/5
Akt/5
Akt/5
Akt/6
Akt/6
Akt/6
PI3K/5
PI3K/5
PI3K/5
PI3K/6
PI3K/6
PI3K/6
D、RunMethod界面:
设置温度;随后修改“ReactionVolumePerWell”,将其改为“20μL体系”;
E、点击“StartRun”
三、注意事项
01、注意一定要禁止气泡。
吸液体时,观察枪头中有没有气泡和液体;打加入液体时,延管壁加入,枪头只能打到第一档,随后观察枪头有没有打尽;
02、加入引物时,一定要涡旋混匀;
03、Rox加入后,一定要避光;
04、加入的液体一定要等量;
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