微生物学检验操作流程及评分标准.docx

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微生物学检验操作流程及评分标准

显微镜的使用操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

掌握显微镜的使用方法及注意事项

用物

准备

光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂

素质要求

让学生能够熟练使用显微镜

操

作

步

骤

1.安放：

把显微镜放在自己前面略偏左的桌面上，这样便于用左眼观察物像，用右眼看着画图。

安放时镜筒向前，镜臂向后。

2.对光：

转动转换器，使低倍物镜正对通光孔，并使物镜前端与载物台有两厘米左右的距离。

然后把反光镜对着光源，但是反光镜不能直接对着太阳。

只要视野的光亮程度合适，光就对好了。

3.观察：

对好光后，把显微镜玻片标本放在载物台上，并使玻片上的标本对着通光孔的中心，再用压片夹夹住。

然后慢慢地转动调焦螺旋，直到接近玻片为止。

接着，用左眼向目镜内注视，同时反方向转动调焦螺旋，直到看清物像为止。

4.再放大：

选好一个放大目标，再把要放大的部分移到视野正中心，如果物像不清楚，再转动调焦螺旋。

如果还观察不清楚，就必须换用高倍物镜。

用高倍物镜观察时，高倍物镜顶端离玻片很近，稍不小心，镜头就会压到玻片，所以要特别小心。

5.在显微镜里看到的物像是倒像，因此，要使物像向上移动，就要向下移动玻片；要使物像向左移动，就要向右移动玻片。

注

意

事

项

1.先用低倍镜观察，用低倍镜能看清的，就不再用高倍镜。

2.必须保护好镜头。

3.载物台要保持清洁干燥。

4.转动调焦螺旋不要用力过猛，以防损伤机件。

5.取用显微镜要轻拿轻放，要用右手握镜臂，左手托镜座。

6.使用完毕，要把显微镜外表擦干净，并把镜筒旋下至最低处。

最后把显微镜放入镜箱，送回原处保存。

细菌的形态学检验操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

掌握革兰染色的基本原理和操作方法

用物

准备

革兰染色液、生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂

素质要求

能够熟练对细菌标本进行染色，观察结果，对细菌进行分类

操

作

步

骤

（1）涂片：

取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。

用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。

（2）干燥：

让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。

（3）固定：

干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。

固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色。

（4）染色：

结晶紫---卢戈碘液---95％乙醇----稀释石炭酸复红---待干、镜检（初染）----（媒染）----（脱色）----（复染）

注

意

事

项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色时间。

2.染色过程中勿使染色液干涸。

3.选用幼龄的细菌。

G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。

基础培养基的制备与灭菌操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

掌握基础基础培养基的配制流程、灭菌的方法及注意事项

用物

准备

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/LHCl

试管、吸管、平皿、锥形瓶、量筒、吸管、精密PH试纸、天平、滤纸

素质要求

要求熟练操作培养基的配制和灭菌

操

作

步

骤

一、培养基的配制

1.配制溶液 

2.调节pH值 

3.过滤 

4.分装 

二、培养基的灭菌

 1.开盖 

 2.通电

 3.加水     

4.放样     

5.设定温度和时间 

注

意

事

项

1．调节PH值时，要边滴氢氧化钠边搅拌，不能一次加太多

2．加热时间控制好，否则培养基会煮糊。

3．灭菌是要注意将灭菌锅里的空气排干净。

4．注意灭菌的时间和温度的控制。

细菌的接种培养法操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

掌握细菌的接种方法及操作流程

用物

准备

温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔

素质要求

能够熟练操作各种接种方法

操

作

步

骤

（一）平板划线接种法（又称分离培养法） 

烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷，从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。

划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育培养24小时后观察结果。

（二）斜面培养基接种法  

试管口部于火焰上往返通过2~3次灭菌，将灭菌白金环伸入有菌试管中，取少量细菌，然后移至准备接种的试管中。

接种方法是自管底向上连续平划线，若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。

取出接种环，将试管上部再经火焰灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌后放回原处。

（三）半固体培养基穿刺培养法

灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可。

注

意

事

项

1．选择适合其生长需要的培养基

2．防止污染。

培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。

3．防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌。

细菌的分布操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

熟悉细菌在自然界和人体的分布，了解外界因素对细菌的影响

用物

准备

待测水样、泥土、无菌吸管，平皿，无菌生理盐水

素质要求

让学生熟悉细菌在自然界和人体的分布情况

操

作

步

骤

1.空气中细菌的检查

（1）方法：

取普通平板（或血平板）1个，选室内或室外的一处空间，在离地面1m左右高度的桌面（或台面）上，打开平板盖，让培养基暴露于空气中，10min之后，迅速盖好盖子，在底部写上标记，放35℃培养18~24h，观察结果。

（2）结果观察

2．水中细菌检查

（1）方法：

1）用无菌三角烧瓶以无菌的方法采集水样。

2）用无菌吸管吸取1ml水样以无菌技术加入无菌平皿中。

3）趁热（不烫手为宜），倾注约15ml的普通琼脂，立即在台面上轻轻转动平皿使其混匀。

待琼脂凝固后，将其放入35℃，培养18~24h。

（2）结果观察报告。

3．人体咽喉部细菌检查

（1）方法：

1）采样

持无菌棉拭1根，待受试者张大嘴巴后，迅速伸入对方悬臃垂后的咽喉部，轻轻揩取咽喉壁上的分泌物。

2）接种

以无菌方法用棉签在琼脂平板的一角（1/4处）来回划线，去掉棉拭，然后用接种环在原划线上过2~3下，接着往下划线分离。

3）培养

写上标记，将平板放35℃，18~24h培养。

注

意

事

项

1.注意无菌操作，防止空气或人体上的细菌污染。

2．倒入的培养基温度大约在45℃左右（热而不烫手为宜），太热，太冷都不行。

细菌对抗药物敏感试验操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

掌握药敏试验的方法、原理、结果判读、临床意义

用物

准备

供试菌种、普通琼脂培养基、药敏纸片、培养起、平皿、镊子、试管、酒精灯、涂布棒

素质要求

要求学生熟练操作纸片扩散法

操

作

步

骤

1．配制培养基

2.配制菌悬液

3.涂布于琼脂平板的表面

4.室温下干燥3-5分钟

5.贴药敏纸片

6.35℃培养16-18小时

7.测量抑菌圈直径，参照相关标准判读结果。

注

意

事

项

1.培养基的质量

2.药敏纸片的质量,含药量和保存方式

3.接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一,取决于麦氏比浊标准的配制,正确使用和保存

5孵育条件,温度和时间

6抑菌圈测量工具的精度

7质控菌种本身的药敏特性是否合格,有无变异。

糖发酵试验操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

熟悉葡萄糖发酵试验的原理和操作方法。

用物

准备

大肠杆菌，糖发酵管

素质要求

熟悉大肠杆菌对葡糖糖的发酵情况。

操

作

步

骤

1.取两支HL葡萄糖培养基，置沸水中水浴10分钟。

2.冷却，将待检细菌接种到2支培养基中。

3.取其中一支加灭菌的液体石蜡，使其与空气隔绝，另一管不加液体石蜡

4.35℃培养18-24小时，观察结果

注

意

事

项

配制糖发酵管内装的小倒管在接种细菌前应是无气泡存在的，否则不能进行接种

甲基红试验操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

熟悉甲基红试验的原理和操作方法。

用物

准备

菌种、葡萄糖蛋白胨培养基，甲基红

素质要求

能利用甲基红试验对大肠杆菌进行鉴定

操

作

步

骤

1.将待检的细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中

2.35℃培养18-24小时

3.滴加甲基红试剂

4.结果：

呈红色为阳性，黄色为阴性。

注

意

事

项

1.注意无菌操作

2.注意观察指示剂的变化

病毒的分离培养操作流程及评分标准

项目

内容

分值

扣分标准

扣分

目的

了解鸡胚培养常见的几种接种方法；

掌握鸡胚尿囊腔接种的操作技术。

用物

准备

受精卵、孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。

素质要求

要求能够对不同的病毒通过鸡胚进行培养

操

作

步

骤

一、准备蛋胚

二、接种

1.绒毛尿囊膜接种

将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，选择血管较少的地方做一记号，并在记号处的卵壳上磨开一三角形小窗，用小镊子揭去所开小窗处的卵壳，小心地划破壳膜，用针尖刺破气室小孔处的壳膜，用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0．05—0．1ml病毒液于绒毛尿囊膜上。

涂上半凝固的石蜡，将鸡卵保持人工气室在上方的位置37℃培养，48—96小时观察结果。

2.尿囊腔接种

将蛋胚在检卵灯上照视，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。

用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。

用带18mm长针头的1ml注射器吸取病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液。

用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。

3.羊膜腔接种

将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

用齿钻在气室顶端磨一三角形，用镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴，用镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，用26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入病毒液0．1ml。

将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时。

4.收获

注

意

事

项

防止污染：

接种全过程要求无菌操作。

为减少污染，要求方法简单、操作迅速 。

（2）温度要适宜，接种过的鸡胚，要根据所接种的病原体生长增殖所需要的温度，置温箱中孵育。