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自噬
自噬
内容:
1)什么是自噬?
包括自噬的定义、形态学特征、分子基础、调控等
2)自噬的意义
自噬与细胞存活、细胞死亡、疾病、衰老等的关系
3)怎么研究自噬?
主要谈谈怎么证明细胞发生了自噬,即自噬的判断标准和各种研究自噬的方法及局限性。
透射电镜下自噬的照片:
上图的英文说明:
自噬的特性:
1)自噬是细胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎对细胞不利。
事实上,细胞正常情况下很少发生自噬,除非有诱发因素的存在。
这些诱发因素很多,也是研究的热门。
既有来自于细胞外的(如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等),也有细胞内的(代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等)。
由于这些因素的经常性存在,因此,细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2)自噬过程很快,被诱导后8min即可观察到自噬体(autophagosome)形成,2h后自噬溶酶体(autolysosome)基本降解消失。
这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3)自噬的可诱导特性:
表现在2个方面,第一是自噬相关蛋白的快速合成,这是准备阶段。
第二是自噬体的快速大量形成,这是执行阶段。
4)批量降解:
这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
5)“捕获”胞浆成分的非特异性:
由于自噬的速度要快、量要大,因此特异性不是首先考虑的,这与自噬的应急特性是相适应的。
6)自噬的保守性:
由于自噬有利于细胞的存活,因此无论是物种间、还是各细胞类型之间(包括肿瘤细胞),自噬都普遍被保留下来(谁不喜欢留一手呢?
)。
自噬相关基因(autophagyassociatedgene,ATG):
在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与,即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。
由于自噬研究的历史关系,很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
在http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
rid=eurekah.table.24964中介绍了一些较早发现的自噬相关基因,下面列出几个新近发现的:
1)bif-1(又叫EndophilinB1)和UVRAG(ultravioletirradiationresistance-associatedgene)
相关文章:
Bif-1interactswithBeclin1throughUVRAGandregulatesautophagyandtumorigenesis.pdf
2)VMP1(Vacuolemembraneprotein1)
相关文章:
ThePancreatitis-inducedVacuoleMembraneProtein1TriggersAutophagyinMammalianCells.pdf
3)DRAM(damage-regulatedautophagymodulator)
相关文章:
DRAM,ap53-InducedModulatorofAutophagy,IsCriticalforApoptosis.pdf
4)TP53INP2(TumourProtein53InducedNuclearProtein2)
相关文章:
TheTP53INP2ProteinIsRequiredforAutophagyinMammalianCells.pdf
自噬过程的调控:
从上面总结的自噬特点中可以看出,自噬这一过程一旦启动,必须在度过危机后适时停止,否则,其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。
这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察,任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
目前,已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬,如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有:
抑制类
1)ClassIPI3Kpathway(PI——phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)
与IRS(Insulinreceptorsubstrate)结合,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高抑制自噬)
详细介绍参见:
维基百科http:
//en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase
2)mTORpathway(mammaliantargetofrapamycin)
mTOR在人类中的同源基因是FRAP1(FK506bindingprotein12-rapamycinassociatedprotein1),是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。
能接受多种上游信号,如ClassIPI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化。
详细介绍见:
http:
//en.wikipedia.org/wiki/MTOR
激活类
1)ClassIIIPI3K
结构上类似于ClassIPI3K,但作用相反。
接受上述信号的自噬蛋白:
目前都把焦点集中在beclin1(酵母同源物为atg6),能与多种蛋白结合,如Vps34(ClassIIIPI3K的催化亚单位),mTOR,BCL-2和BCLXL蛋白等,更多介绍请参阅OMIM:
http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?
id=604378。
在【动态版】
需注意的是,beclin-1是一个多功能蛋白,除了接受自噬信号,它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节,越来越多的证据表明,beclin-1可能是自噬的“守门人”。
自噬体的发生:
目前认为,自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网,而是在胞浆中重新生成的,但具体的机制尚不清楚。
当beclin-1被活化后,胞浆中先形成很多个membranesource(自噬体膜发生中心),在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome),VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上(VMP1又叫TMEM49,已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白),同时,MAP1-LC3由胞浆型(即LC3-I)转位到自噬体膜(即LC3-II),LC3这一转变过程可被WesternBlot和荧光显微镜检测到,现已成为监测自噬体形成的推荐方法。
自噬与细胞死亡的关系:
有必要说明一下的是,细胞死亡是一个非常复杂的过程,为了研究方便,需进行分类,但我们思考时不要局限于这些人为的分类,而应注重于现象本身来研究其背后的机制。
一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡,并把细胞的死亡方式分为2类:
坏死和凋亡,因为两者有着明显的区别,其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性,内容物被释放出来,染料可自由进入细胞,而凋亡细胞保持完整,无内容物释放,染料也被排斥。
很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡,这将在后面一一介绍,如同刚刚说明的那样,这些实验只能说明细胞膜的通透性(必要条件,不是充分必要条件),而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。
一般认为坏死是被动的,不可控的,而凋亡是主动的,可控的。
为了强调这一点,凋亡被定义为程序性细胞死亡(programcelldeath,PCD)。
但无论是坏死还是凋亡,都是一个过程,是需要时间的(尤其是凋亡,从启动到完成,细胞要执行很多反应),而且细胞死亡后都有“尸体”。
在研究自噬与凋亡的关系时,人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体,但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点,如核固缩(pyknosis),核破裂(karyorhexis)、细胞皱缩(shrinkage)、没有凋亡小体的形成等,被称为自噬样细胞死亡(autophagiccelldeath,ACD),它是一种新的细胞程序性死亡,为了与凋亡区别,被命名为TypeIIcelldeath,相应的,凋亡为TypeIcelldeath,坏死为TypeIIIcelldeath。
尽管这样,但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。
到底是Celldeath by autophagy(自噬引起死亡)还是Celldeath with autophagy(死亡时有自噬发生,但不是直接原因)?
对此,自噬研究领域“大牛”级专家LevineBeth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。
由于在形态学上2者无明显区别,但通过阻断自噬,观察细胞的结局可区分开来:
Celldeath by autophagy细胞存活,而Celldeath with autophagy细胞死亡。
Autophagiccelldeath:
thestoryofamisnomer.pdf
自噬与肿瘤的关系:
与凋亡(在肿瘤细胞中一般都存在缺限)不同,自噬是被优先保留的。
无论是肿瘤细胞还是正常细胞,保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。
因为细胞中随时产生的“垃圾”(破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等)都需要及时清除,而这主要靠自噬来完成,因此,自噬具有维持细胞自稳的功能;如果将自噬相关基因突变失活,如神经元会发生大量聚集蛋白,并出现神经元退化。
同时,自噬的产物,如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物,可以说,自噬就是一个“备用仓库”。
如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。
更重要的是,自噬活性可在代谢应激(饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等)时大大增强
,表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体,这一现象被称为“自噬潮”(autophagicflux),广泛用于自噬形成的监测。
自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持,有利于细胞的存活。
鉴于自噬的上述作用,自噬可为肿瘤细胞带来几大好处:
1)肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点,对营养和能量的需求比正常细胞更高,但肿瘤微环境往往不能如意,如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断,而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。
2)当化疗、放疗后,肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分,而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质,并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。
由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会,而对于肿瘤细胞群体而言,需要一部分细胞发生坏死,以引发适度的炎症(有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等)。
研究发现,很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬(由于凋亡通路已受阻,抑制自噬会促进坏死),但具体机制尚不清楚。
参考文献:
Autophagyandtoll-likereceptors:
Anewlinkincancercells.pdf
Autophagyfightsdiseasethroughcellularself-digestion.pdf
Roleandregulationofautophagyincancer.pdf
Roleofautophagyincancer.pdf
AutophagyandCellDeath:
NoLongeratOdds.pdf
Autophagyandcancer:
Dynamismofthemetabolismoftumorcellsandtissues.pdf
自噬的研究方法:
正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有:
(一)自噬诱导剂
1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin:
模拟内质网应激
2)Carbamazepine/L-690,330/LithiumChloride(氯化锂):
IMPase抑制剂(即Inositolmonophosphatase,肌醇单磷酸酶)
3)Earle's平衡盐溶液:
制造饥饿
4)N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):
ClassIPI3KPathway抑制剂
5)Rapamycin:
mTOR抑制剂
6)XestosponginB/C:
IP3R阻滞剂
(二)自噬抑制剂
1)3-Methyladenine(3-MA):
(ClassIIIPI3K)hVps34抑制剂
2)BafilomycinA1:
质子泵抑制剂
3)Hydroxychloroquine(羟氯喹):
Lysosomallumenalkalizer(溶酶体腔碱化剂)
除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:
包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
1)观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。
Phagophore的特征为:
新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。
自噬体(AV1)的特征为:
双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。
自噬溶酶体(AV2)的特征为:
单层膜,胞浆成分已降解。
(autophagicvacuole,AV)
2)在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成:
由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。
无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3)利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成:
自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
(Note:
LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。
方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。
)
4)检测长寿蛋白的批量降解:
非特异
5)MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:
包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。
6)CellTrackerTM Green染色:
主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。
在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。
由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:
Lamp-2:
溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM探针:
有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:
载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker探针:
特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60:
定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin(钙网织蛋白):
内质网腔
【Note:
这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeablize),可采用0.1%SDS处理】
自噬与细胞死亡经常需一起考虑,下面介绍一些检测细胞死亡的方法:
(1)△ψm dissipation(线粒体跨膜电位的消失):
TMRM发红色荧光,DiOC6(3)发绿色荧光。
(2)PhosphatidylserineExternalization(磷脂酰丝氨酸外翻):
AnnexinV-FITC(绿色)染细胞膜。
(3)检测线粒体产生的ROS:
无荧光的HE(hydroethidine,氢化乙啶)可被ROS氧化为EthBr(ethidiumbromide,溴乙啡啶),发红色荧光。
NAO(nonylacridineorange,烷化吖啶橙,可发荧光)能与非氧化的cardiolipin(心磷脂,可被ROS氧化)反应而失去荧光。
(4)线粒体IMS蛋白的释放:
AIF,细胞色素c,分别用荧光二抗染色。
(5)Capase3a染色:
用荧光二抗染色,胞浆弥散分布。
(6)细胞膜完整性检测:
DAPI(蓝色)、Hoechst33342或PI(红色)染核。
胞膜完整的细胞(活细胞和早中期凋亡细胞)排斥,可联用annexinV。
【如何用实验区分Celldeathbyautophagy和Celldeathwithautophagy】
第一步:
利用上述方法证实细胞死亡
第二步:
证实细胞死亡前发生了自噬
第三步:
在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡
第四步:
利用遗传学手段(反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34)或工具药抑制自噬
第五步:
细胞存活则为Celldeathbyautophagy,反之,细胞死亡则为Celldeathwithautophagy。
参考文献:
MethodsforAssessingAutophagyandAutophagicCellDeath.pdf
CytosolicLC3RatioasaSensitiveIndexofMacroautophagyinIsolatedRatHepatocytesandH4-II-ECells.pdf
自噬领域的牛人一BethLevine
http:
//www.utsouthwestern.edu/utsw/cda/dept131456/files/181499.html
以autophagy命名的杂志
自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。
在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性,其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合,消化,也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。
自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。
Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。
LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物,和前者相比,LC3除了定位在自噬体分隔膜上,也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上,在自噬溶酶体膜上也可见。
通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP,即可实现对自噬体的检测。
③单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。
是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。
自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与IVIDC特异结合的生化标志,通过荧光染色,在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。
④间接自噬体检测法。
自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。
自噬体和溶酶体融合后,除上述的LC3-GFP法检测外,还有吖啶橙染色法。
它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针,在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。
对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。
自噬的抑制
根据自噬形成的过程,自噬的抑制也分为不同的阶段,包括自噬的起始阶段,自噬泡和溶酶体融合阶段,以及溶酶体内的降解阶段。
目前常用的一些抑制药物如下:
(1)对自噬体形成的抑制:
主要是PI3K通路的抑制剂(如3-MA,Wortmannin,LY294002等),这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。
3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂,可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成,被广泛用作Autophagy的抑制剂。
另外,渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002也可用作Autophagy的抑制剂。
(2)对自噬体与溶酶体融合的抑制:
对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用,这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。
巴伐洛霉素A1(BafilomycinA1)是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素,分子式C35H58O9,是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂,具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。
当突触小泡经历胞外分泌时,巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。
有研究表明,在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1,可使蛋白降解被抑制,自噬体增多而自噬溶酶体数目减少,并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低,从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。
这种阻断是可逆的,在去除了药物作用后,自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体,继续自噬进程。
(3)对溶酶体降解的抑制:
自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解,它首先经过囊泡酸化,达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解,降解产物在细胞内再循环利用。
对溶酶体的降解进行抑制,使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内,而不能释放出来进入细胞内再循环利用,这也同样起着抑制自噬的作用。
因此,蛋白酶抑制剂,如E64d、PepstatinA等,在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。
E64d和PepstatinA均属于蛋白酶抑制剂,二者以1:
1的比例联用可以抑制自噬。
有研究表明,在结肠癌细胞系中联用E64d及PepstatinA,可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展,而自噬体的形成并没有受到明显影响。
大自噬(Macroautophagy)即我们说的自噬(autophagy)
微自噬(Microautophagy):
是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy,CMA):
一些分子伴侣,如hsc70,能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
另外,几个与phage相关的概念:
吞噬(phagocytosis):
细胞主动吞掉胞外的细菌、碎片、或其它细胞。
吞饮(pinocytosis):
胞外的液体
异噬(heterophagy):
吞噬、吞饮的统称,强调所吞内容物来自细胞外,它们都是单层膜的液泡。
自噬体(autophagosome)形成后,可与吞噬泡或吞饮泡融合,然后再与溶酶体融合,但这一过程的证实还需更多的实验来支持。
自噬体增多,也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多,二是与溶酶体融
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