蛋白片食品卫生质量评价.docx
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蛋白片食品卫生质量评价
蛋白片食品卫生质量评价
蛋白片卫生质量评价的微生物指标主要有细菌总数、大肠菌群最可能数(MPN)、致病菌等指标。
蛋白片中的致病菌主要为沙门氏菌。
蛋白片中细菌污染的来源
蛋白片细菌即指常在蛋白片中存在的细菌,包括致病菌、条件致病菌和非致病菌。
非致病菌一般不引起人类疾病,但其中一部分为腐败菌,与蛋白片腐败变质有密切关系,是评价蛋白片卫生质量的重要指标。
细菌污染主要来源
1)、原料污染
2)、中间环节污染
3)、从业人员污染
4)、蛋白片存贮不当污染
蛋白片中细菌危害
细菌在蛋白片中存活时,可以通过活菌的摄入引起人体(通常是肠道)感染——食品感染;或预先在蛋白片中产生的细菌毒素导致人类中毒——食品中毒。
蛋白片中细菌总数的测定
一、实验目的
1.学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理;
2.了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。
二、实验原理
菌落总数是指食品经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别蛋白片被污染程度的标志,也可以应用这一方法观察细菌在蛋白片中繁殖的动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。
三、器材
蛋白片样品营养琼脂培养基无菌生理盐水无菌培养皿,无菌移液管酒精灯等。
四、实验步骤
1 取样、稀释和培养
1.1 以无菌操作取检样25g(或ml),放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振要或研磨制成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:
10的均匀稀释液。
1.2 用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:
100的稀释液。
1.3 另取1ml灭菌吸管,按上项操作顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。
1.4 根据标准要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制作10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。
1.5 稀释液移入平皿后,将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。
1.6 待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。
2 菌落计数方法
作平皿菌落计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平皿的菌落总数后,求出同稀释度的各平皿平均菌落数。
到达规定培养时间,应立即计数。
如果不能立即计数,应将平板放置于0-4℃,但不要超过24h。
3 菌落计数报告方法
3.1 平皿菌落数的选择
选取菌落数在30~300之间的平皿作为菌落总数测定标准。
每一个稀释度应采用两个平皿平均数,其中一个平皿有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平皿的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。
3.2 稀释度的选择
1)应选取平均菌落数在30~300之间的稀释度报告
2)若有二个稀释度均在30~300之间时,应以二者比值决定,比值≤2取平均数,比值>2则其较小数字
3)若所有稀释度均>300,则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
4)若所有稀释度均<30,则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之
5)若所有稀释度均无菌落生长,则应按<1乘以最低稀释倍数报告之
6)若所有稀释度均不在30~300之间,有的>300,有的又<30,则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之
3.4 菌落计数报告方法
菌落数在1~100时,按实有数字报告,如大于100时,则报告前面两位有效数字,第三位数按四舍五入计算,为了缩短数字后面的零数,也可以10的指数表示。
五、 结果记录
1 将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。
2 对蛋白片样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。
菌落总数的蛋白片卫生学意义:
①直接意义:
可作为被蛋白片细菌污染程度(即清洁状态)的标志;
②间接意义:
可推断蛋白片鲜度,耐保藏性和致病性。
蛋白片中大肠菌群污染的来源
大肠菌群是一组来自人和温血动物肠道(粪便)、在35~37℃下能发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.包括肠肝菌科的埃希菌属(典型肠杆菌属)、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属(后三者为非典型肠杆菌属)。
大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。
据调查,蛋白片中大肠菌群细菌多存在于家禽的粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方。
蛋白片中大肠菌群的危害
大肠杆菌是一组革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是人和动物肠道的正常菌群,多不致病,且在肠道中合成B族维生素和维生素K而被动物利用。
当宿主免疫力低下或大肠杆菌侵入肠外组织和器官时,可引起肠外感染。
有少数菌株可直接引起肠道感染,这些大肠杆菌称为致病性大肠杆菌。
致病性大肠杆菌有4种,即肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌。
肠产毒性大肠杆菌主要在小肠内繁殖,致病物质是不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种毒素,这两种毒素可引起腹泻。
肠侵袭性大肠杆菌是国际公认的食物中毒病原菌,主要黏附结肠黏膜上皮细胞并在此生长繁殖,死亡后产生内毒素,引起肠黏膜细胞的炎性反应和溃疡,出现血性腹泻。
肠致病性大肠杆菌在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖,一般不产生肠毒素,可引起水样腹泻,粪便中带有黏液。
肠出血性大肠杆菌,可产生志贺样毒素,可导致出血性结肠炎、严重腹泻和便血。
大肠杆菌主要来自人和动物的粪便,因此要加强饲养管理,严格清除传染源,对环境进行消毒,以防止大肠杆菌的感染。
蛋白片中大肠菌群的测定
一、实验目的
1、了解大肠菌群在蛋白片中卫生检验中的意义。
2、学习并掌握大肠菌群的检验方法。
二、原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价蛋白片中的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。
它反映了蛋白片中是否被粪便污染,同时间接地指出蛋白片中是否有肠道致病菌污染的可能性。
蛋白片中中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(themostprobablenumber简称MPN)表示。
三、材料
1、样品
蛋白片
2、菌种
大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)
产气肠杆菌(Enterobacteriaaerogenes)
3、培养基及试剂
单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂(EMB)、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)
4、其它设备和材料
温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。
四、实验步骤
(一)检验程序
大肠菌群检验程序见图5—2
(二)操作步骤
1.采样及稀释
①以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:
10的均匀稀释液。
固体检样最好用无菌均质器,以800r/mjn—1000r/min的速度处理1min,做成1:
10的稀释液。
②用1mL灭菌吸管吸取1:
10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇混匀,做成1:
100的稀释液,换用1支lmL灭菌吸管,按上述操作依次作10倍递增稀释液。
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。
也可直接用样品接种。
2.乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。
其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。
将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者,用单料乳糖发酵管。
每一个稀释度接种3管,置(36土1)℃培养箱内,培养(24土2)h,的所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,勿有产生者,则按下列程序进行。
如有产生者,则按下列程序进行。
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上,置(36土1)℃温箱内,培养18h一24h,:
然后取出,观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验,其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌,确能发酵乳糖产生气体。
在上述的选择性培养基上,挑取可疑大肠菌群1—2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置(36士l)℃的温箱内培养(24土2)h,观察产气情况。
检样
稀释
乳糖胆盐发酵管
36±1℃,24±2h
产气
不产气
伊红美蓝琼脂平板
36±1℃,18-24h
大肠杆菌阴性
报告
乳糖发酵管
36±1℃,24±2h
革兰氏染色
不产气
革兰氏阴性无芽孢杆菌
革兰氏阳性
大肠菌群阴性
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
报告
报告
报告
凡乳糖发酵管产气.革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌,即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性,则报告为大肠杆菌为阴性。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表(见表5—4),报告每100mL(8)蛋白片中大肠菌群的最可能数。
蛋白片中沙门氏菌的来源
污染途径:
(1)人和动物或带菌者可通过各种途径将病原菌散布开来,牧场、鸡场均通过饲料、饮水、污水传播,尤其是通过水传播。
(2)已被沙门氏菌污染的食品或食物,通过人的手、苍蝇、鼠类或其他物品作为媒介,可将病菌带至蛋白片中。
蛋白片中沙门氏菌的来源:
(1)家畜、家禽的生前感染和宰后污染
(2)蛋类沙门氏菌的来源
蛋白片中沙门氏菌的危害
引起食物中毒:
1)沙门菌在肠道内繁殖,并通过淋巴系统进入血液,引起全身感染(使胃肠粘膜发炎、水肿);
2)细菌可在肠系膜淋结和网状内皮系统中被破坏而放出内毒素;
3)沙门菌亦可产生外毒素,称沙门菌肠毒素。
(内、外毒素使消化道蠕动增强,呕吐、腹泻)
致病力:
猪霍乱沙门氏菌>鼠伤寒沙门氏菌>鸭沙门氏菌
蛋白片中沙门氏菌的测定
1材料与方法
1.1设备和材料
冰箱:
2℃~5℃、恒温培养箱:
36℃±1℃,42℃±1℃、均质器
电子天平:
感量0.1g、无菌锥型瓶:
容量500ml,250ml
微量移液器及吸头、无菌培养皿:
直径90mm、振荡器、
无菌试管:
3mm×5mm、10mm×75mm、无菌毛细管、
精密pH试纸、三角烧瓶。
1.2培养基和试剂
1)缓冲蛋白胨水(BWP):
称取20.1g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全溶解,分装三瓶,121℃,灭菌15min。
2)四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:
称取93.6g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全溶解,分装试管,每管10ml,121℃,灭菌20min,此上配制的为基础液,冷却至30℃,每10ml基础液加入碘液2ml,0.1%煌绿液1ml,混匀备用。
3)亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:
称取23.0g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全溶解,分装试管,每管10ml,无需高压灭菌,冷却至常温立即使用。
4)亚硫酸铋(BS)琼脂:
称取39.3g,加蒸馏水950ml,搅拌加热煮沸至完全溶解,无需高压灭菌,为基础液;称取8g指示剂,加水50ml,水浴50℃左右,搅拌溶解,将50ml指示剂加入950ml已冷却到50℃的基础液,混匀后立即倾注平板。
5)HE(HektoenEnteric)琼脂:
称取90.8g,加蒸馏水1L,搅拌加热煮沸至完全溶解,无需高压灭菌,冷却到50℃,立即倾注平板。
6)三糖铁(TSI)琼脂:
7)蛋白胨水、靛基质试剂:
8)尿素琼脂(PH7.2):
9)氰化钾(KCN)培养基及其对照氰化钾培养基:
10)赖氨酸脱羧酶试验培养基及其对照培养基:
11)甘露醇及山梨醇培养基:
12)邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:
2、检验程序
2.1沙门氏菌检验程序见图1.
42℃±1℃,18h~24h36℃±1℃,18h~24h
36℃±1℃,40h~48h36℃±1℃,40h~48h
图1沙门氏菌检验程序
3操作步骤
3.1培养基的配制
按照1.2的部分配制。
3.2前增菌
称取25g样品放入盛有25mlBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打90S。
样品为液态,直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。
3.3增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取5ml,转种于10mlTTB内;于42℃±1℃,18h~24h培养。
同时,另取5ml,转种于10mlSC内,于36℃±1℃,18h~24h培养。
3.4分离
分别用接种环取经TTB增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。
同时,另取SC增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个HE琼脂平板。
于36℃±1℃分别培养18h~24h(HE琼脂平板)或40h~48h(BS琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。
表1沙门氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
沙门氏菌
BS琼脂
菌落为黑色有金色光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变
HE琼脂
蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色
3.5生化试验
3.5.1接种生化培养基
自选择性琼脂平板上,分别挑取两个以上典型或可以菌落,接种到三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种环不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和对照管,并加入已灭菌液体石蜡3-4滴覆盖培养基表面。
于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。
接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基、甘露醇和山梨醇试验。
所有试管于36℃±1℃分别培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。
讲已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或温室至少保留24h,以备必要时复查。
3.5.2生化结果观察与判断
3.5.2.1在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌的反应结果见表2。
表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
赖氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
斜面
底层
产气
硫化氢
-
+
+(-)
+(-)
+
可疑沙门氏菌属
-
+
+(-)
+(-)
-
可疑沙门氏菌属
+
+
+(-)
+(-)
+
可疑沙门氏菌属
+
+
+/-
+/-
-
非沙门氏菌属
注:
+阳性,-阴性;+(-)多数阳性,少数阴性;+/-阳性或阴性。
表2说明,在三糖铁琼脂内斜面产酸,底层产酸,同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除,其他的反应结果均有沙门氏菌属的可能,同时也均有不是沙门氏菌属的可能。
3.5.2.2通过TSI反应中的H2S、靛基质试验、尿素琼脂(pH7.2)、KCN实验结果,查表3讲可疑反应分为A1、A2、A3。
表3沙门氏菌属生化反应初步鉴定表
反应序号
硫化氢
(H2S)
靛基质
pH7.2尿素
氰化钾
(KCN)
赖氨酸脱羧酶
A1
+
-
-
-
+
A2
+
+
-
-
+
A3
-
-
-
-
+/-
注:
+阳性,-阴性;+/-阳性或阴性。
3.5.2.3反应序号A1:
典型反应判定为沙门氏菌属。
如尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。
如有2项异常为非沙门氏菌。
表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素
氰化钾(KCN)
赖氨酸脱羧酶
判定结果
-
-
-
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)
-
+
+
沙门氏菌Ⅳ和Ⅴ(要求符合本群生化特性)
+
-
+
沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)
注:
+阳性,-阴性。
3.5.2.4反映序号A2:
做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
3.5.2.5反应序号A3:
做ONPG,ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
ONPG试验结果为深黄色是阳性,淡黄色为阴性。
必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
ⅤⅥ
Ⅵ
山梨醇
+
+
+
+
+
-
ONPG
-
-
+
-
+
-
氰化钾(KCN)
-
-
-
+
+
-
卫矛醇
+
+
-
-
+
-
水杨苷
-
-
-
+
-
-
丙二酸盐
-
+
+
-
-
-
注:
+阳性,-阴性。
4实验结果与分析
4.1沙门氏菌检测结果如表6
三糖铁琼脂
斜面
-
pH7.2尿素
-
底层
+
KCN
+
产气
+(-)
靛基质
-
硫化氢
+(-)
甘露醇
-
赖氨酸脱羧酶试验培养基
-
山梨醇
-
注:
+阳性,-阴性;+(-)多数阳性,少数阴性;+/-阳性或阴性。
4.2实验分析
从三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果,查看表2可知菌属为可疑型沙门氏菌属,查表3发现氰化钾和赖氨酸脱羧酶两项结果为异常,所以检测结果为非沙门氏菌属。
实训小结
大二下学期6月份,我们农产品卫生检验科目开始了为期一周教学实训,我有幸跟我系的苏爱梅老师进行学习。
实习的地点就在我系办公楼微生物实验室,以前我们曾在这里上过实验课,所以并不陌生。
这次大家来到实验室为自行选择课题进行相关实验操作,在老师的带领下进行了蛋白片质量卫生评价。
通过这次实训从而得知蛋白片卫生质量评价的微生物指标主要有细菌总数、大肠菌群最可能数(MPN)、致病菌等指标。
了解蛋白片中细菌总数的来源、危害以及测定方法,得知大肠菌群的来源、途径及测定方法。
更了解沙门氏菌是我国大部分地区引起病人腹泻的主要病原菌,也是人畜共患的常见病原菌。
因此我们应加强卫生知识普及与宣传工作,以减少夏秋季肠道传染病及食物中毒。
通过这次严谨而生动的实验实习,为我们先前在教学中学习到的知道提供了一个实际的操作实施平台,也为今后在这方面检验技术的工作起到了指引作用。
在过去的学习中,我们并不了解具体的微生物实验室检验技术的具体流程,注意事项等等非常关键和必须的防御手段。
通过上学期生产实习,使我们对以前所不熟知的问题有了深入的认识,也对目前的情况有所思考和感悟。
在我看来,农产品卫生检验在我国国民生活中起到了关键作用,民以食为天,没有认真负责的实验检测,将给社会带来巨大的饮食灾难,为此,我感到非常自豪和骄傲。
在今后的工作学习中,我将一如既往的认真下去,无愧自己的职责和称号。
在此感谢我的院各级领导,特别是我的指导老师苏爱梅老师。
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