质谱原理六.docx
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质谱原理六.docx
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质谱原理六
质谱原理(六)
ESI和APCI的异同!
ESI为电喷雾,即样品先带电再喷雾,带电液滴在去溶剂化过程中形成样品离子,从而被检测,对于极性大的样品效果好一些;
APCI
为大气压力化学电离源,样品先形成雾,然后电晕放电针对其放电,在高压电弧中,样品被电离,然后去溶剂化形成离子,最后检测,对极性小的样品效果较好。
ESI的软电离程度较APCI
的还小,但其应用范围较APCI的大,只有少部分ESI做不出,可以用APCI辅助解决问题,但是APCI还是不能解决所有ESI
解决不了的问题。
一般用ESI和APPI搭配使用比ESI
和APCI的应用范围更广一些。
电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。
电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。
这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。
根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。
电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。
电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。
这样,一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000Da,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。
根据这一特点,目前采用电喷雾电离,可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。
大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物。
有些分析物由于结构和极性方面的原因,用ESI不能产生足够强的离子,可以采用APCI方式增加离子产率,可以认为APCI是ESI的补充。
APCI主要产生的是单电荷离子,所以分析的化合物分子量一般小于1000Da。
用这种电离源得到的质谱很少有碎片离子,主要是准分子离子。
APCI与ESI源都能分析许多样品,而且灵敏度相似,很难说出哪一种更合适。
同时至今没有一个确切的准则判断何时使用某一种电离方式更好。
但是通常认为电喷雾有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物,而APCI更适合于分析极性较小的化合物。
APCI源不能生成一系列多电荷离子,所以不适合分析生物大分子。
而ESI源由于它能产生一系列的多电荷离子,特别适合于蛋白质,多肽类的生物分子。
ESI和APCI共同点:
1、使用高电压元件和雾化气喷雾法产生离子
2、通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子
3、产生极少的碎片,但可以控制产生结构碎片
4、非常灵敏的电离技术。
不同点:
1、生成离子的方式不同,ESI:
液相离子化;APCI:
气相离子化
2、样品兼容性
ESI:
极性化合物和生物大分子
APCI:
非极性,小分子化合物(相对ESI而言)且有一定挥发性3、流速兼容性
ESI:
0.001到1ml/min
APCI:
0.2到2ml/min
4、ESI的适用范围要远远大于APCIAPCI优点∶
1.利用所得到[M+1]+及[M-1]–进行分子量确认
2.源参数调整简单,容易使用
3.耐受性好,喷雾器及针的位置不关键
4.LC流速可达2.0ml/min
5.好的灵敏度
缺点:
1.有限的结构信息
2.易发生热裂解
3.低质量时化学噪声大
4.不适合做分子量大于1000的化合物
傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS)
我们知道FT-ICR
MS具有超高的分辨率和质量准确度,与其他质谱相比具有无与伦比的优势,但是其可控参数较多,调试比较复杂,要得到一副高质量的谱图,需要在仪器调试过程中下很大功夫,还需要对仪器的结构原理有较深入的了解。
以下是我在应用过程中的一些经验,我个人觉得以下几点很重要:
在调试过程必须要注意的几条规则:
1.样品浓度要合适;
2.样品酸碱度要适当;
3.检测池中离子数目不能太多;
4.离子的能量要合适;
5.离子的累积时间并不是越长越好。
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网上在线免费化学物性、光谱和反应数据库
物性、质谱、晶体结构数据库
http:
//factrio.jst.go.jp/
简介:
该数据库收录了有机化合物的物性、质谱、晶体结构等数据,数据主要取自LANGE'SHANDBOOKOFCHEMISTRY
12/e,JPHYSCHEMREFDATA
Vol.1,No.4,841-1009(1972)以及SicherheitstechnischeKennzahlen
brennbarerGaseundDaempfe
2.Auflage。
截至97年8月,热物理和热化学性质数据库Kelvin收录数据共有61,480条;质谱数据库Dalton收录15,526条以及晶体结构数据库Angstrom收录9,169条。
用户经免费注册后即可以检索并下载所需要的数据,但是个人下载的总量不得超过数据库总量的10%。
通过精确质量确定元素组成:
从四极杆到傅立叶变换离子回旋共振质谱仪
利用质谱测定元素组成的方法已被广泛应用于各种领域研究,如:
药物研发、药物代谢、环境研究、法医、食品安全、香精香料、兴奋剂以及天然产物等。
传统的观念认为,要测定元素组成,必须获得高质量精度;而高质量精度只能从高分辨率质谱获得,如:
TOF,
Orbitrap或者FTICRMS。
最新的傅立叶变化离子回旋共振质谱仪(FT-ICR
MS),其质量分辨率达到800,000:
1,通过它可以得到<200
ppb的质量精度。
但即使在如此高的质量精度下,仍然会存在好几个候选的化学式,必须依靠我们去选择和推断。
而在飞行时间质谱(TOF)上,典型的质量精度约为5ppm,通常候选的化学式有5~10个,加大了选择和推断的难度。
而且不幸的是,在所有上述情况下,正确的结果往往不是质量误差最小的候选化学式。
所以仅仅依靠精测质量一个条件,不可能得到唯一可靠的化学式。
但这些有着非常近似质量的候选者,由于元素组成不同而产生了不同的同位素分布,这个特点可用于进一步区分它们。
过去,研究者通过调节峰的宽度,来模拟和假定一个同位素高斯分布,试图用这个高斯峰形来区分上述的差异。
但由于候选者彼此间同位素分布的差异极小(通常只有几个百分点),所以过去的方法常常是失败的,除非化合物中存在特征元素如Cl和Br。
为了区分同位素分布之间的微小差异,发展了一种综合的、同时包括质荷比(m/z)校正和更为重要的、峰形校正的方法,可以获取高精度的谱图,从而得到唯一的、正确的元素组成。
而且,在低分辨的四极杆或者三重四极杆类型质谱仪上,也可用这种校正方法来获得唯一的化学式。
实验:
未知化合物(m/z=399
Da)和内标(m/z=410
Da,C28H60N+,精确质量410.4726
Da)混合,然后直接进样进入WatersQuattro三重四极杆质谱。
用MassWorks软件进行质量轴和峰形的校正,得到1,517种可能的化学式。
而排在第一位的C25H23N2OS+质谱准确度为99.44%。
这个来自盲样分析样品的化学式在随后被合作者认为是正确的。
而同样的化合物,使用质量精度达到100ppb的FT
ICR质谱,仅仅以质量精度为条件搜索,会得到5个候选化学式,排在第一位的仍然是争取的C25H23N2OS+结果。
结论:
虽然质量精度在确定元素组成时非常重要,但即使使用高分辨率的FTMS质谱,如果仅仅应用质量精度一个条件,我们仍不能确定唯一的化学式。
另一方面,对轮廓模式采集的质谱进行正确校正,以正确的同位素轮廓为基础,我们得到新的度量参数——谱图精度,它使我们即使使用单位分辨率的质谱,也可以获得唯一的、正确的化学式。
长期以来,由于生物样品的非挥发性、热不稳定性以及分子量大等特征,质谱的应用仅局限于对小分子的分析。
但上世纪80年代的两项电离技术的发明:
基质辅助激光解吸附(MALDI)和电喷雾(ESI)技术,使这一情况发生了戏剧性变化,同时也促进了质谱仪器的巨大发展,包括新的质量分析器的研发和各种多级的复杂的仪器的设计和组合层出不穷,如混合型四极杆飞行时间质谱(Q-Q-ToF)、串联飞行时间质谱(ToF-ToF)、混合型离子阱傅利叶变换离子回旋共振质谱(IT-FTICR)、轨道回旋共振Orbitrap质谱等。
如今的质谱不仅可以对生物分子进行简单的质量测定,还可以对其分子结构、修饰位点和修饰种类进行测定。
生物质谱仪通常包括三个部分:
离子源、质量分析器和检测器。
质量分析器是质谱的核心元件,决定着生物质谱的灵敏度、分辨率、质量准确度和生成大量信息的碎片离子谱图的能力。
目前在生物质谱领域有四种基本的质量分析器:
飞行时间、四极杆、离子阱和傅利叶变换离子回旋共振、Orbitrap,它们的设计和性能不尽相同,各有其优点和劣势。
这些分析器可以独立使用,也可以串联使用以发挥各自的优点。
1.质谱仪器的种类
1.1四极杆(Q)质谱仪
四极杆质谱仪的质量分析器是由四根棒状的电极组成,两对电极中间施加交变射频场,在一定射频电压与射频频率下,只允许一定质量的离子通过四极杆分析器而达到检测器。
四极杆质谱仪的突出优点是仪器结构简单,体积小,没有磁铁作分析器,所以没有磁滞效应,扫描响应速度快。
其缺点是分辨率比较低。
四极杆质谱仪有多种组合类型,早期主要是单级四极杆质谱仪,该仪器与ESI或APCI离子源联用可以对分析物进行定性和定量分析。
单级四极杆质谱仪依靠选择离子监控(SIM)方式完成定量分析,但是单级四极杆不能进行真正意义上的串级质谱分析(MS/MS),只能通过源内裂解模式得到部分碎片离子而实现类似MS/MS的功能。
多级四极杆的发展使四极杆质谱具有了强大的分析功能,可以实现所有的MS/MS扫描方式,包括子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描等。
三级四极杆是目前普遍使用的四极杆质谱,第一级四极杆选母离子,第二级四极杆作为碰撞室对母离子进行碰撞解离,第三级四极杆作为质量分析器完成离子分析。
三级四极杆采集到的MS/MS质谱图信息量大,并且较少发生重排反应,因而四极杆的质谱数据质量要高于离子阱串联质谱数据。
1.2飞行时间(ToF)质谱仪
对于飞行时间分析器,分析物的质荷比是根据分析物在真空飞行管中的飞行时间推算出的。
飞行时间质谱的质量分析器由调制区、加速区、无场飞行空间和检测器等部分组成。
样品分子电离以后,将离子加速并通过一个无场区,不同质量的离子具有不同的能量,通过无场区的飞行时间长短不同,可以依次被收集检测出来。
早期的时间飞行质谱由于受飞行距离的限制,分辨率很低,近年来采用了一些调节离子飞行距离的离子光学系统和延迟技术,如各种离子反射透镜等,目前,飞行时间分析器的分辨率和质量精确度有了很大提高,一般的仪器的分辨率均可达到12000左右,质量准确度在经过严格的质量校正程序后可达到PPM级,而检测的离子质量范围达到几十万。
ToF质谱仪也经历了由单级向多级串联使用的发展历程。
与四极杆质谱仪类似,单级ToF只具有简单的质量分析功能。
不同的是,除了源内裂解外(当与MALDI联用时)离子在飞行过程中容易发生源后裂解(PSD)而产生亚稳离子,这种方式也能实现MS/MS分析的部分功能。
ToF-ToF可能是目前应用最为广泛的质谱仪之一,其较快的图谱扫描速率(约100-200张图谱/秒)、高分辨率和高质量精确度极大地满足了
蛋白质组学研究中的各种需求。
AB公司生产的ABI4700MALDI
ToF-ToF是这类质谱仪器的代表,该仪器由MALDI离子源、两级ToF、高能碰撞池、离子反射镜及检测器等部分组成,离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦,对于MS模式可以直接由线性检测器检测。
MS/MS模式下,通过第一级ToF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级ToF重新被加速并被分析。
最近AB公司又推出了功能更加完善的ABI4800系统,可以看作是4700的升级产品。
相对于ABI4700,ABI4800采用了垂直立式设计离子光路更长;另外,对靶系统和激光系统也进行了改进采用了与MALDI靶完全垂直的激光光路设计。
1.3离子阱质谱仪
离子阱质谱仪是一种串联质谱仪,在分析前先将离子聚集储存,离子阱是该仪器的核心部分,既可以作为碰撞室,又可以作为质量分析器。
传统的离子阱(三维离子阱,即3D离子阱)由三个双面电极围成一个离子捕集室(一个环形电极,两个端盖电极),在环形电极射频电压的作用下,离子聚集在捕集室中心运动,在端盖电极上加电压可以选择出不同共振频率的离子进入检测器,也可以选择只有一种离子留在捕集室中,再用高速惰性气体碰撞诱导解离产生子离子,进行串联分析。
离子阱可以储存所有从离子源进入阱中的离子,因此灵敏度极高。
但同时,随着阱内离子数目的增加,空间电荷效应以及其他电场效应会导致被测离子频率的偏移,从而影响测量的准确度和分辨率,这种问题可以通过自动增益控制(AGC)设置控制进入离子阱的离子数量得以部分解决。
线性离子阱(即2D离子阱)在3D离子阱基础上对离子阱的设计作了改进,使2D离子阱具有更大的离子容量和扫描速度。
由此可见,离子阱的构造决定了离子阱只是一种中低分辨率的质谱,离子阱的优势在于,它具有非常强的离子储存和选择功能(RF电压扫描)。
1.4离子回旋共振(ICR)质谱仪
傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)是质谱中十分重要的一类仪器,它是根据离子在磁场中会进行回旋运动的特性设计的。
FTICR是一种具有超高分辨率和质量准确度的质谱仪器,其核心部分是由超导磁体组成的强磁场,和置于磁场中的ICR盒组成。
FTICR因有超导体存在,必须在液氦的温度和超高真空的真空系统下工作,因此对环境的要求非常高。
Obitrap质谱仪器是目前世界上质量精确度最高的仪器,可以达到亚PPM级,其核心部分是一个具有离子储存功能的C-Trap和质量分析器Obitrap。
Obitap分析器由一个纺锤状电极组成。
离子在高压射频作用下从从C-Trap注入Obitrap,在Obitrap中离子在磁场的作用下围绕中央的纺锤状电极震荡旋转,同时产生轴向的镜像电流,通过傅立叶转换后获得离子的质谱信号。
C-Trap
除了具有储存离子功能外,还能起到静息离子的作用,因此可以有效消除离子空间电荷效应。
Obitrap质谱仪器与FTICR质谱相比可以获得更高的质量精确度和分辨率,但是却不需要超导磁场环境,维护起来也更方便。
1.5混合型质谱仪
Q-ToF是由四极杆质谱和飞行时间质谱组成的串联型质谱仪,因此无论是在MS或MS/MS模式下均具有较高的分辨率和质量精确度。
在MS模式下,四极杆具有离子导向作用;在MS/MS模式下,四极杆具有质量分选功能,第一级四极杆对母离子进行选择,离子的碰撞解离则在第二级四极杆中进行。
装有反射器的飞行时间(TOF)分析装置与四极杆垂直配置,在MS和MS/MS状态下均有质量分析功能。
在进行MS/MS质谱实验时,第一级四极杆质谱选取单一离子并将它送入碰撞活化室与惰性气体发生碰撞并使母离子发生诱导裂解,碰撞活化室由六极杆组成,在工作状态下四极杆上仅有射频电位,因而所有离子均能通过碰撞活化室,到达垂直飞行时间质谱的加速器中,在推斥极的作用下,离子进入TOF-MS进行质量分离,仪器的最终检测器为高敏感性的微通道板。
由于此仪器配以电喷雾电离源(ESI)和基质辅助激光电离源(MALDI),可以分别实现与高效液相色谱联用或直接进样。
为适应研究的需要进一步提高分辨率,此仪器装有多级反射器(W型),由于多级反射,其分辨率可达20000(FWHM)左右,Q-Tof可以进行多种模式的质量检测,主要包括MS
Scan、TOFMS和TOFMS/MS,这些模式同样可以用于负离子的检测。
Q-IT,即由四极杆和离子阱组成的混合型质谱。
例如,美国应用生物系统公司研制的QTRAP就是这一类仪器的代表。
该质谱仪是将三重四极杆质谱仪(QqQ)中的最后一级四极杆(Q3)改为线性离子阱(LIT)设计而成,并可以通过电喷雾(
ESI)和大气压化学电离(APCI)与HPLC联用。
其独特之处在于Q3
同时具有线性离子阱和传统四极杆的功能,且在离子阱模式下MS/MS的灵敏度比常规的三重四极杆型高出数十倍至数百倍,同时作为四极杆操作时保留传统三重四级杆型的扫描模式,可以选择子离子扫描(PROS),、母离子扫描(
PRES),、中性丢失扫描(NLS),以及多反应监测或选择反应监测(MRM或SRM),并且使全扫描方式的灵敏度提高。
同时克服传统3D
离子阱的一些缺点,如低质量截止现象(1/3
效应)、碰撞效率低和定量分析性能较差等。
因此,QTRAP的这种设计方式不但提高灵敏度而且也增加信息量,兼有定性和定量分析的功能,而且增加多种扫描功能和IDA
(InformationDependant
Acquistion)等软件功能,使得QTRAP?
型串联质谱仪很快在有机化合物结构分析、药物筛选及其代谢物定性及定量分析和蛋白分子研究等方面发挥独特作用。
QTRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪
主要应用领域
1、该系统主要应用于药物开发、农药、兽药残留分析、有机化学、配位化学研究等有机小分子领域小分子药物代谢分析,在同一仪器上对代谢物进行快速定性鉴定和定量分析
表征合成药物、天然产物提取物等的结构,推测其断裂机理,并快速定量农/兽药残留定性和定量分析食品/环境中毒物分析
遗传疾病的临床诊断分析等
2、该系统也可应用于蛋白质组学(多肽、蛋白及其它生物活性物质)的定性、定量研究
进行高通量的蛋白质鉴定和单个凝胶斑点的鉴定进行大量高丰度蛋白的体系中痕量的低丰度蛋白的鉴定
准确确定蛋白质翻译后修饰(如:
磷酸化、糖基化、乙酰化等)的个数和位点可自动进行denovo的测序
研究蛋白质的共价和非共价的相互作用与疾病相关蛋白质(biomarker)的分析
仪器特点
QTRAP
四级杆-线性离子阱质谱仪把串联四级杆-线性离子阱技术首次结合在一起,既保留了串联四极杆质谱仪的优点,如母离子扫描(PS)、中性丢失扫描(NL)、MRM定量功能,又克服了传统3D离子阱质谱仪诸如低质量截止点(1/3效应)、“空间电荷效应”、碰撞效率低、定量功能差缺点,并可以作为独立的两种仪器进行操作,是一台集优异定性与定量功能于一体,广泛用于蛋白质(组)研究、药物开发、药物代谢、残留分析、检验检疫等生物大分子和有机小分子领域的全能质谱仪
当Q3(第三极四级杆)作为串联四级杆使用时,QTRAP是一台标准串联四级杆质谱仪,保留诸如母离子扫描、中性丢失扫描等串联四极杆扫描功能,优异的多反应检测MRM定量功能,宽的动态线性范围,连同高能量的碎裂能力,在小分子研究领域,尤其是对天然药物、药物代谢和药物残留分析等,都具有单纯的离子阱质谱仪不可比拟的优越性
当Q3作为线性离子阱使用时,QTRAP保留传统三维离子阱质谱仪全扫描灵敏度高、分辨率好、多级碎裂(MS3)等优点,同时克服传统三维离子阱质谱仪的固有缺陷:
质量歧视效应(1/3质量效应)、空间电荷效应(QTRAP空间扩大200倍)、定量线性范围差(QTRAP
6个数量级,三维离子阱
4个数量级)、质量准确度差等;QTRAP独有的增强性多电荷扫描(EMC)和时间延迟碎裂(TDF)功能,从不同方面降低噪音,简化图谱,降低数据信息解析的复杂性;QTRAP质谱仪的增强分辨率功能,可以准确确定离子的电荷状态,从而大大增加化合物鉴定的可靠性、区分结构相近的化合物和杂质;多种串联质谱模式和多级串联质谱功能,确保蛋白质修饰位点的准确确定
另外,QTRAP整机中采用了多项专利设计,可配置多种离子源和接口,具有灵敏度高、测量范围宽、选择性好等特点,同时为了满足化合物筛选和评价实验的需要。
革新性的LINACTM线性加速碰撞室,有效消除记忆效应,使仪器的分析速度大大加快,在做MRM的同时,采集MS/MS数据,进行结构鉴定,即可以在一次进样过程中,同时实现定性、定量分析;专利高压聚焦Q0、Q2四极杆及预四极杆技术保证了100%的离子传输率,大大提高了灵敏度,只需极少量样品(fmol级)即能对化合物进行结构鉴定;专利‘气帘接口设计’既保证灵敏度又保持了抗污染能力,无需狭窄的毛细管设计,仪器不会堵、且不需经常清洗,同时无需加热的接口设计,防止了样品的降解;更新设计的离子源、内置分流阀、注射泵等,可进行快速而简便的操作等
QTRAP扫描功能
·
增强全扫描(EMS):
增加离子的利用率,便于微量分析
·
增强子离子扫描(EPI):
增加离子的利用率,便于微量分析
·
增强分辨率扫描(ER):
准确确定离子的电荷状态
·
母离子扫描(PR):
有效确定子离子和母离子间的关系,对化合物筛选、分类,有利于定性和断裂机理分析
·
中性丢失扫描
(NL)有效确定子离子和母离子间的关系,对化合物筛选、分类,有利于定性和断裂机理分析
·
增强多电荷扫描(EMC),有效降低噪音水平,提高信噪比
·
时间延迟碎裂扫描(TDF):
简化图谱,有利于图谱解析
·
多级串联质谱功能(MS3,addin-sourcedissociation,
actuallyMS4):
结构信息丰富多级串联质谱功能(MS3,addin-sourcedissociation,
actuallyMS4):
结构信息丰富
·
选择离子扫描(SIM):
用于经典的LC/MS定量分析
·
选择反应监测扫描(SRM):
用于经典的LC/MS/MS定量分析
·
多反应监测扫描(MRM):
可同时检测300对离子,用于样品中多组分的同时、快速、高通量定量分析
·
混合扫描(MixedScan
Mode):
一次进样完成上述所有扫描模式,获得更多信息正/负离子快速切换扫描(切换时间<700ms
):
便于进行化合物筛选和结构分析
QTRAPLC/MS/MS技术性能:
API离子源
·
配置TurbolonSpray(ESI)、HeatedNebulizer
(APCI)两种离子源
·
流速范围分别为2-1000ul/min和0.2-2.0ml/min
离子光学和四极杆质量分析器
·
专利碰撞聚焦四极杆Q0保证离子的最大传输率
·
专利线性加速碰撞LINAC技术可消除记忆效应,并提高灵敏度
检测系统
·
脉冲计数检测器可快速进行正/负离子检测方式切换
·
动态范围:
1―4E6cps
真空系统
·
专利差分涡轮分子泵分流技术,空气冷却,无需维护
·
断电后自动关闭系统
数据处理和控制系统
·
WindowsNT/2000界面,可自动进行数据实时和后处理
·
快速进行交替MS和CID/MS扫描
·
UV输入和LC控制
·
可控制不同厂家的9种LC泵,注射泵和自动进样器
·
可控制UV,荧光和ECD等检测器,与质谱仪同时采集数据美国应用生物系统公司4700TOF/TOF蛋白质组分析系统
4700TOF/TOF蛋白质组分析系统是全球第一台TOF/TOF
串联飞行质谱仪,它作为目前的最新质谱技术,它一问世即被世界各大蛋白组研究中心和著名蛋白质实验室所争相采用。
它由两级TOF和高能碰撞池组成,其工作原理是离子在MALDI源中产生并被加速和聚焦;对于MS/MS
模式可通过第一级TOF选择母离子进入高能碰撞池中碰碎,然后进入第二级TOF重新被加速并被分析。
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