大肠杆菌.docx
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大肠杆菌.docx
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大肠杆菌
最近一次在美国爆发的大肠杆菌流行影响了12个西部州和600万磅的肉类。
这表明我们急需一种更好的进行探测的设备。
来自Drexel大学化工系的教授Raj Mutharasan发明了一种可以在10分钟内检测出肉类中大肠杆菌的感应器。
他目前正在和一家公司合作,计划将这一产品商业化。
与此同时,此种探测器还能在医学诊断(如前列腺癌)以及检测生物武器方面得到应用。
在医疗上,它能被用于分析4种常见的体液:
血液、尿液、唾液和脑脊液。
目前的检测食物中大肠杆菌的测试需要大约24小时,并且需要在实验室进行。
而Mutharasan的仪器能实现手提,且容易操作。
目前市场上没有快速测试少量蛋白的设备,在《Analytical Chemistry》的文章中,利用Mutharasan的仪器可以检测出最低浓度大肠杆菌。
Mutharasan的设备达到了在千分之一升溶液中4个细胞的检测灵敏度。
感应器使用了大肠杆菌抗体来进行探测,这类似于我们身体的工作机制。
抗体和一窄条玻璃结合,玻璃另一端是陶瓷层,它将通过产生电压对机械压力产生反应。
在陶瓷层施加电压后,会导致其膨胀和收缩,从而震荡玻璃。
感应器通过探测玻璃的共振频率的改变来确定是否有大肠杆菌的存在以及其浓度。
此外感应器还可以探测液体和固体样本,它能搭载各种不同的抗体来实现多种抗原的检测,并且此感应器可以实现对于有害细菌的极微量的测量。
近日,科学家发现新的生物传感器,它能精确而快速地检测出传染因子,包括大肠杆菌的细菌能通过食物导致疾病传播。
这项独一无二的技术是由罗彻斯特大学医学中心的研究人员发现的,他们从可疑细菌中提取一种蛋白质作为感觉系统(如硅片或数码相机)的一部分。
在传统检测方法中,细菌只能存活几天,而这种新型的生物传感器存活的时间可以持续到拍摄过程结束。
罗彻斯特研究小组称这种技术为“阵列成像反射法”。
该检测系统主要将硅片制成一定形状以便激光反射切断芯片,并且,只有在目标细菌存在的情况下,这些芯片才可以被看到。
这种蛋白质提取自细菌,这种易位Intimin受体(Tir)蛋白被放置于芯片中,研究人员可以在“分子叉”中观察到Tir。
大肠杆菌将叉状物植入细胞,这时,Tir会绑定一种叫做Intimin的大肠杆菌蛋白。
在芯片中的Tir位置和样本中任何大肠杆菌之间也发生有同样的过程。
探针样本与细菌改变芯片表面进行结合,数码相机拍摄芯片便可随即俘获相关分析进而成像。
该新技术较为廉价,研究人员称甚至在将来某一天,医生可用其来鉴定咽喉痛患者的链球菌感染情况。
(李雪华译)
以SN标准方法为例,进行说明。
样品制备:
以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:
10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
LST和EC初步筛选:
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
将接种管置于36±1℃培养48±2h。
观察试管的产气情况:
检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。
生化试验:
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
1色氨酸肉汤:
在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
2MR-VP培养基:
在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
3Koser氏枸椽酸盐肉汤:
于36±1℃培养96h记录有无生长。
4LST肉汤:
于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
5革兰氏染色:
取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛基质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐┃鉴定(型别)
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+┃ + ┃ - ┃ - ┃典型大肠杆菌
-┃ + ┃ - ┃ - ┃非典型大肠杆菌
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+┃ + ┃ - ┃ + ┃典型中间型
-┃ + ┃ - ┃ + ┃非典型中间型
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-┃ - ┃ + ┃ + ┃典型产气肠杆菌
+┃ - ┃ + ┃ + ┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告:
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++
--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值。
大肠杆菌O157:
H7压电免疫传感器研究及表征
王丽江,吴春生,王平
(浙江大学生物医学工程与仪器科学学院生物传感器国家专业实验室,杭州310027)
1引言
大肠杆菌O157:
H7是肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)的一个主要菌型,会产生很强的毒素,感染后可以导致婴幼儿腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜甚至死亡。
它是最危险的病原体之一,感染剂量非常低。
自1982年美国首次发现该菌引起的食物中毒以来,EHECO157:
H7疫情开始逐渐扩散和蔓延,相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行。
如何快速地检测出该菌是疫情控制的关键,目前的常规检测技术还不能很好地满足实际需要,因此研究快速准确的检测大肠杆菌O157:
H7的新方法具有重要意义。
2实验部分
整套检测系统均由实验室自己搭建,其简单示意图见图1。
在压电免疫传感器的制备中,利用巯基物质在金表面的自组装特性,在QCM电极表面形成稳定有序的MHDA自组装膜;通过EDC/NHS的活化作用在电极表面形成活性酯中间体,使抗O157:
H7的特异抗体能有效地固定到SAMs上;因抗原抗体的特异性结合,将样本中的目标菌O157:
H7捕获到电极上,最后通过频差(△f)分析实现了对细菌的定量检测(试验流程见图2)。
为了表征电极表面的修饰过程,一方面运用SEM对每步处理后的电极表面进行观察,直观地反映电极表面形态变化;另一方面利用循环CV来分析电极表面修饰程度以及修饰层的稳定性。
最后,采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH=11)对免疫传感器的再生性进行了研究。
3结果和讨论
实验结果显示,压电免疫传感器制备和检测的各步均会引起相应的频率改变(图3),系统的检测下限可达2.0×102CFU/mL,检测线性范围为2.0×102~2.0×108CFU/mL,单个样本的检测时间只需1.5h。
菌液浓度和频差(△f)关系如图4所示,二者关系呈类S型。
SEM结果证实基于巯基自组装膜,抗体被有效固定,从而目标菌可以被成功捕获。
CV结果显示,电极表面的修饰和大肠杆菌的固定确实影响了电子转移电阻,引起电流的改变(图5,6)。
在稳定性和再生性研究中发现,该压电免疫传感器经修饰后放置(4℃)一周内均可用于榆测;而检测后经甘氨酸-氢氧化钠缓冲液处理,尚可重复使用3次左右。
由此可见,该检测系统的检测限较低、检测时间短;免疫传感器稳定性好,并有一定的再生性,因此未来有望将其集成为便携式检测装置用于实时检测,为准确、快速地检测病原微生物打下坚实基础。
基于生物发光技术的细菌总数快速检测仪
岳伟伟,周爱玉,何保山,罗金平,蔡新霞
(1.中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室,北京100080;2.中国科学院研究生院,北京100080)
1引言
细菌总数检测是食品卫生学检测领域的重要检测指标,主要是用来判断食品被污染的程度。
对细菌总数进行快速准确的检测一直是该领域内重要的研究课题。
对细菌总数进行检测的国标方法是平板计数法,需要将样品用营养琼脂37℃培养48h记数,测试时间长,操作繁琐,不适合现场检测。
ATP生物发光检测方法具有检测速度快、成本低、易于操作等特点,已引起众多研究者关注。
同时,因为ATP生物发光技术以生物体内的ATP作为检测对象,不仅包括细菌,也包括体细胞在内的食品残渣等食品污染物,因此适合在食品卫生检测领域对卫生状况进行快速检测。
使用ATP生物发光技术测量ATP最早见于1949年Mcelroy的报道。
自此以后,ATP生物发光技术引起广泛关注。
本文在分析前人工作的基础上,设计了一种ATP生物发光检测仪,选择光电倍增管(H5773-02,日本,滨松光子)作为光电转换器件,其峰值响应波长为500nm,与反应所发荧光波长基本一致,从而提高检测灵敏度。
本检测仪采用自动加样技术,在加入被检测样品后,在反应腔内由自动加样装置向检测样品池中自动加入反应试剂,从而既避免了外界光的干扰,也有效地提高了加样精度,从而提高了仪表的检测可靠性及准确性。
利用本检测仪对10-6~10-14mol/L标准ATP样品进行了检测,输出信号与样品浓度间的相关性达到0.986,可以满足测量要求。
2系统设计
2.1检测原理
ATP即三磷酸腺苷,是广泛存在于生物体内的一种能量物质。
实验证明,在生理条件下,每个细菌细胞中所含ATP的含量大致相同,约为10-18mol/个。
萤火虫荧光素酶简称虫光素酶,是一种能将化学能转变为光能的活性蛋白质,即生物催化剂。
ATP在虫光素酶的催化作用下,与荧光素在有氧环境及二价镁离子作用下,反应释放出荧光。
当荧光素及虫光素酶过量情况下,释放的荧光与ATP在一定范围内成线性关系,因此可以通过测量荧光光强检测样品中的ATP,进而检测其中的细菌总数。
2.2结构设计
本检测仪的结构如图1所示,主要包括三部分,分别为自动进样单元、光电转换单元和信号采集处理及控制单元。
其中,自动进样单元包括三套蠕动泵(WX10,保定兰格恒流泵有限公司)和试剂盒,分为独立三路加样通路,分别为体细胞裂解剂、细菌细胞裂解剂和荧光素一荧光素酶发光试剂。
根据测试需要,蠕动泵在控制单元控制下,向光电转换单元中的样品池加入对应反应试剂。
光电转换单元包括检测样品池和光电转换器件。
为消除外界光的干扰,整个光电转换单元被密封在暗盒中。
光电转换器件将反应释放荧光转化为电信号,由信号采集处理单元采集并处理,并对测试结果进行实时显示和存储。
2.3电路设计
系统的电路结构如图2所示。
光电转换器件将荧光信号转换为电流信号,通过微处理芯片ADuC834(AnalogDevices,美国)对信号进行采集及处理。
ADuC834同时作为控制核心,控制自动加样单元,显示及存储单元,并可将测量结果通过RS232接口上传至上位机以进行结果分析。
2.4软件设计
检测仪表的操作软件由C语言编写,软件结构如图3所示,共分三项功能模块,分别为测量、记录和仪表设置。
其中,测量分为仪表独立测量和连接电脑测量。
仪表独立测量时,微处理芯片ADuC834对一定时间内的信号采集并进行积分处理,然后将测试结果实时显示,根据用户选择也可将测试结果上传至计算机;联机测量时,ADuC834对所采集的信号不进行处理,而是直接将其传送到上位计算机中,并实时显示时间响应曲线,方便用户在计算机对所测数据进行分析,适合于实验室中的测试分析。
记录子菜单分为记录查询和记录删除,用以对记录进行操作。
采用24LC256作为外部数据存储芯片,本仪表设计可存储测试结果200条,记录查询时可对逐条记录进行显示;记录删除则分为逐条删除和全部删除;设置子菜单可实现仪表校准和倍增管电压调整两项功能。
3实验与结果
3.1器件选取
由于ATP生物发光所发光强较弱,因此本检测仪选用高灵敏的光电倍增管作为光电转换器件。
利用F-4500荧光分光光度计(日本,日立)对ATP生物发光反应所发荧光波长进行扫描,峰值波长约为550nm。
为保证检测具有更高灵敏度,所选光电倍增管的响应波长应与荧光波长一致。
日本滨松光子的H5773-02型光电倍增管的响应波长为330~850nm,峰值检测波长在500~600nm基本保持恒定,因此符合本系统设计要求。
3.2结果与讨论
实验选择标准ATP样品作为检测对象,浓度范围为10-6~10-14mol/L,实验中所用荧光素及荧光素酶购自美国普洛麦格公司。
实验采用联机测量方式,将本检测仪与计算机通过。
RS232接口相连接,仪表信号采集单元采集荧光信号后直接上传至计算机并将测试结果实时显示。
测量结果如图4所示。
在反应中,加入发光反应试剂时,体系中样品浓度相对较高,因此在短时间内即迅速反应释放大量荧光,此时荧光光强较强,因此测量结果可能会超出系统的测试量程。
由于本仪表的最大输出电压为2500mV,反应初期释放的荧光可能会超出该范围,在图中表现为前端的水平直线。
随着反应进行,体系中样品和试剂的浓度逐渐降低,所释放荧光随之逐渐衰减。
由图可见,不同样品浓度的ATP随反应进行,进入测量量程的时间不同,浓度越高,衰减越慢,进入测量量程的时间越长,反之越短。
对图4中各响应曲线400s内的测量值进行积分,作为各浓度样品的输出信号。
输出信号与浓度的关系如图5所示。
由图可以看出,输出信号随浓度增加而增加,且有明显梯度,两者的线性相关系数达到0.986。
这一结果说明本检测系统可以对ATP浓度进行快速检测。
由于细菌细胞中所含ATP含量基本一致,因此,本检测仪可实现对细菌总数的现场快速检测。
4结论
本文针对细菌总数检测需求,设计了一种基于ATP生物发光技术的细菌总数快速检测仪。
该检测仪在对现有产品进行分析的基础上,选择H5773-02光电倍增管作为光电转换器件,其检测波长与生物发光反应所释放荧光波长一致,可有效提高检测灵敏度。
采用自动加样技术,在暗室内加入发光反应试剂,消除了外界光的干扰,且获得了反应最初的信号。
本文以细菌检测的中间产物标准ATP溶液作为检测对象,对所设计的检测仪进行测试。
将检测仪与计算机连接测量,获得了各反应所释放荧光强度的时间响应曲线。
在此基础上,对响应曲线400s内的值进行积分,作为对应样品浓度的输出信号,得到了输出电压与浓度的关系曲线,两者的线性相关系数达到0.986,可满足测试要求。
本文所设计的针对细菌总数的检测仪具有检测速度快、自动化程度高、操作简单、小型便携等特点,在口岸、卫生监管部门、食品生产部门等对产品、环境等的卫生状况进行现场快速检测领域具有很好的应用前景。
目前生物荧光反应法被广泛用于食品加工条件的快速评价和食品中微生物的快速检测,同时在HACCP管理中也被广泛用于关键控制点检测,与传统检测方法不同之处在于几分钟内可获得结果,而且荧光光度计是便携式的,使用方便,适合现场检测,不仅可以检测微小的污染物水平,还能检测食品加工设备及其表面的清洁程度。
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