细胞免疫组化.docx
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细胞免疫组化
细胞免疫组化
细胞爬片的免疫组化
1.细胞爬片,5天后进展免疫细胞组织化学染色定。
2.PBS清洗标本3次各1min。
3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。
4.空气枯燥5min。
5.PBS清洗标本3次各2min。
6.0.5%TritonX-100(DPBS配)孵育1次20min。
7.PBS清洗标本3次各2min。
8.3%H2O2〔试剂A〕孵育15min。
9.DPBS清洗标本3次各2min。
10.封闭血清孵育〔试剂B〕20min。
11.一抗孵育〔滴度1:
200,湿盒〕4℃过夜或37℃60min。
阴性对照最好用一抗来源血清,否那么用PBS液
12.PBS清洗标本3次各5min。
13.二抗工作液孵育〔湿盒试剂C〕37℃30min。
14.PBS清洗标本3次各5min。
15.试剂D〔湿盒〕37℃30min。
16、PBS清洗标本3次各5min。
17、DAB显色〔避光,镜下观察至棕色〕约3~10min。
18、蒸馏水洗2次1min。
19、木素复染0.5~1min。
20、自来水洗返蓝。
21.梯度酒精脱水75,85,95,100%各3min。
22.二甲苯透明2次3min。
23、中性树胶封片。
本卷须知:
1、良好的细胞爬片是进展免疫组织细胞的根底,要获得良好细胞爬片须注意以下:
a对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上这样细胞爬片才较结实冲洗时不易脱片;
b接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜,假设密度太高5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,〔不可用吸管太用力吹,易脱片〕
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、TritonX-100外表活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做.
1.如果不看荧光,两种都可以,感觉粘好了再做要快一些,但是做的时候要防止脱落。
如果看荧光,就不能用中性树胶粘,直接在24孔,或6孔板里做才可以。
中性树胶要折光,散射的光干扰,没方法看细胞本身的荧光。
2.孔板里做免疫组化较方便,细胞比盖玻片易贴壁,但染色后不能用二甲苯透明、封片〔可用甘油〕。
细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能,只有开场就让细胞贴在玻片上爬片。
3.我没有在多孔板里做过,其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦,偶这样做很少掉片。
先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上,由于液体的外表力,细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面,等细胞大概贴壁后,不同细胞贴壁时间稍有不同,大概6、7个小时,差不多贴壁再加生长液,开场滴的细胞的数量你要摸索一下,到固定时细胞生长到80%左右比较适宜。
偶是在盖玻片上做的,首先细胞要爬的匀一些,象dongwp战友的就很好。
然后倾去生长液冲洗、固定之后,用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。
擦干盖玻片的反面,在玻片反面四周涂一点凡士林,粘贴于载玻片上,这一点很重要,在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。
细胞爬片的保存和抗原修复问题总结
1.细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多!
!
加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。
但是我建议对于细胞爬片,还是尽量快的进展处理,以防不必要的问题!
2.louischenwrote:
但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定,PBS冲洗后直接就放在了-20度,还能用于免疫组化吗"!
应该没有问题,但是还是现作先染好些,以防抗原的丧失
3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。
其它建议用甲醇固定。
-20度保存
4.如果是4%多聚甲醛固定,然后放在PBS中保存,在4度冰箱里保存两周没问题。
时间再长就没试过了。
5.丙酮中固定5-10分钟,然后风干,放置4度保存过夜应该是没有问题。
不要固定过夜,蛋白质固定过度,会影响抗原的暴露,影响免疫组化结果。
如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果,可考虑应用0.5%的triton-100孵育30分钟,渗透细胞膜。
如果玻片没有经过特殊处理,不要用其他抗原修复的方法,会造成掉片,我曾有过这方面的体会
6.丙酮固定后,PBS洗涤3次,即可保存至4度冰箱备用。
7.
(1)细胞爬片先用TBS洗3次,每次5分钟
(2)4%多聚甲醛固定,室温,20分钟
(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水,通风橱枯燥,-80度保存。
2周没有问题的,我保存过2个月都有信号,不过还是保存时间短一点的好
8.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好
9.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定,用PBS冲洗后,晾干,放在-20度保存一个月没有问题的。
10.细胞爬片,有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后,轻轻摇动玻片或培养皿等,静置2min左右,弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气枯燥,枯燥后的标本可于-70℃长期保存。
解冻时要小心抗原破坏,应先将标本转移于干冰预冷的固定液,然后再将混合液转移至室温下,固定液到达室温时取出标本,再用PBS冲洗,在做以后的步鄹
11.我也做过细胞爬片的组化染色,不过没有遇到类似的问题。
细胞培养好后用PBS洗一遍,然后4%多聚甲醛4度固定15分钟,自然风干。
室温保存几周都可以用的。
我想这可能与抗原的类型有关,有的对氧化等损伤比较敏感,有的差一些。
最好避光保存在4度,同时尽量隔绝空气。
免疫荧光与普通DAB显色差异只再二抗的标记,样品的保存应该是没有多大差异的。
12.细胞爬片丙酮固定后-20度保存,现在要再做免疫荧光,将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了
13.爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜,细胞形态保存较好。
假设爬片需长期保存并出现你这样的问题,原因可能是:
1)试验步骤有误,建议重复并加阳性对照片。
2)加一抗前处理同石蜡切片,可进展抗原修复,如胰酶消化或热修复。
3)因为抗原抗体反响在液相中进展,故对已极度枯燥的爬片充分水化很重要。
建议试验前用PBS浸泡过夜。
如不能解决你的问题请QQ联系:
81825645。
本人在省肿瘤医院病理科(市)做免疫组化。
14.4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以,也有用无水酒精的,固定好后放-20度,2-3个月是没有问题的。
15.对于一般的细胞免疫组化,我的做法是:
细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN,再在通风柜将丙酮吹干,—-20度保存,用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖,穿透性很强,保存抗原的免疫活性好。
所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。
当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。
如:
1.多聚甲醛(常用4%):
可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。
主要检测组织一些性能娇弱的抗原特别是细胞外表抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
2.乙醇。
优点:
穿透性强、抗原性保存较好。
缺点:
但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反响强度
3.甲醛(福尔马林)应用最广优点:
形态构造保存好,且穿透性强,缺点:
甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;分子间交联形成的网格构造可能局部或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
16.4度是不能保存这么长时间(1个月)的,如果抗原已被分解,再修复也没用!
17.弃去固定液,不用PBS洗而是采用空气枯燥,枯燥后的标本可于-70℃长期保存。
18.爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用。
19.固定后放点PBS,然后放在4度冰箱中保存,我最长保存两个月的,然后再做免疫组化,应该没有太大的问题的。
20.固定后4度可以存放一周,-20度存放半年,我现在也要做这个,实验室教师教的。
21.四度放1周应该没问题的,你最好放在-20度,我在-20度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多,不可能一次作完,一个月没问题.
22.最正确的固定及保存方法:
(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH):
福尔马林(40%甲醛,用时参加过量碱式MgCO3中和)10.0ml
Na2HPO4.12H2o1.9653g
NaH2PO4.2H2O0.5460g
加0.85%NaCl溶液溶解,定容至100ml。
(2)细胞固定:
待细胞接近长成单层时,用镊子取出盖玻片,迅速于37℃PBS中漂洗2次,每次3-5秒,以去除血清。
(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。
(4)用镊子取出盖玻片,PBS漂洗2次,每次3-5秒,晾干保存于-20℃备用。
可长期保存,做实验时,取出片子,入PBS湿润后即可进展你的实验。
可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。
(本帖没有加分)
23.细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月可以用.
24.skywalkerzzwrote:
过氧化氢处理这一步,用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢,然后室温下玻片放在其中浸泡10min,是不是过氧化氢导致细胞严重脱片"
爬片应该用甲醇/双氧水,你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片
25.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛,20分钟很好用的。
保存的时候注意片子最好晾干,不要挤压,防止粘片和碎裂。
26.细胞爬片固定好以后,如果要保存,我们的做法是倒掉固定液,PBS漂洗后干片保存在4度,最长半年没问题。
27.1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15min,PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进展免疫细胞化学染色了
2、爬片PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤3遍后是否能保存,怎样保存"
1、洗过就可以做免疫组化了。
2、固定过后自然枯燥,不要洗,-20度保存。
做之前再洗。
28.细胞固定最好用丙酮或酒精,不要用4%多聚甲醛,以免抗原交联,这样组化时不用再抗原修复。
细胞固定后可室温保存在丙酮中,不使之枯燥。
29.如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,
30.适当密度后取出固定(丙酮-20固定10~20min),再进展免疫染色。
31.一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上,冷丙酮固定15-20分钟,然后放-20度,没有问题。
如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进展,冷丙酮会腐蚀板子,最好4%多聚甲醛。
32.细胞爬片用纯丙酮固定10分钟,取出枯燥后用锡纸包裹,-70度保存。
33.4%多聚甲醛固定后PBS水洗,自然枯燥后用锡纸包裹,-20度冻存不超过1月。
34.如果细胞贴壁困难,可将片子先用纯血清挂一层,凉干后再养细胞。
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- 细胞 免疫