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MAPK传导
MAPK级联途径在植物信号转导中
的研究进展①
1陈娅斐
1,2冯斌
1赵小明
1白雪芳1杜昱光②
1
(中国科学院大连化学物理研究所大连116023)
2
(辽宁师范大学生命科学学院大连116029)
摘要促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)在植物的胁迫反应应答方面占有
重要地位。
本文就MAPK的基本组成、分类、激发子和两种可能的机理的最新进展作了综述。
并介绍
了近年来此领域中的研究方法,包括MAPK活性测定的方法、免疫沉淀法、酵母双杂交、基因突变、
RNA干涉和网络模式法。
关键词MAPK,信号转导,研究方法
ProgressofStudyonMAPKCascadesofPlantSignal
Transduction
1
CHENYa-Fei
1,2
FENGBin
1
ZHAOXiao-Ming
1
BAIXue-Fang
1
DUYu-Guang
②
1
(DalianInstituteofChemicalPhysics,theChineseAcademyofSciences,Dalian116023)
2
(CollegeofLifeScience,LiaoningNormalUniversity,Dalian116029)
AbstractMitogen-activatedproteinkinase(MAPK)playanessentialroleinresponsetoavariety
ofstressesinplants.Thispaperreviewstherecentprogressesinthebasicconstitutions,categories,
elicitorsandtwopossiblemechanismsofplantMAPKs.Italsointroducesseveralimportantexperimentalmethodsdevelopedinthisfield,includingkinaseactivitymeasurement,immune-precipitation,
yeasttwo-hybrid,genemutant,RNAinterferenceandanewmethod-networksmodules.
KeywordsMAPK,Signaltransduction,Experimentalmethods
研究简报
蛋白质激酶是一类可以使特定的蛋白质侧
链中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基共价磷
酸化的酶,蛋白质磷酸化可以控制酶的活性及其
与其他分子的相互作用(JohnsonandLapadat,
2002)。
促分裂原活化蛋白质激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)是丝/苏氨酸蛋
白质激酶的一个大家族,包含11个保守的亚结
构域,现已于真核生物(酵母、哺乳动物、人
及植物)中广泛发现(Widmannetal.,1999)。
真
核生物中的MAPK在将外源刺激信号转入胞内
应答受体/感应器的下游的过程中起着枢纽的
作用(Bogreetal.,2000)。
在植物中,MAPK级
联途径与不同的生物及非生物胁迫反应、激
素反应、细胞分化和发育过程有关。
35822(3)
MAPK级联途径在酵母和动物中的研究起
步比较早,植物方面的研究虽然从20世纪90年
代才发展起来,但已经取得了相当大的进步。
本文将就MAPK级联途径的最新进展和研究方
法作一概述。
1MAPK级联途径的基本组成
真核生物(酵母、动物和植物)中与MAPK
级联途径有关的激酶均为丝/苏氨酸磷酸酶,其
基本组成为三级激酶模式,即上游的促分裂原活
化蛋白质激酶激酶激酶(MAPKKK,如哺乳动物
中的Raf和Mos蛋白质家族)通过将促分裂原活
化蛋白质激酶激酶(MAPKK)中保守区域中丝/
苏氨酸残基磷酸化而激活MAPKK,再由
MAPKK通过磷酸化MAPK第七和第八亚结构
域之间的丝/苏氨酸和酪氨酸残基激活MAPK
(Campsetal.,1999),每种MAPKK只可以磷酸
化其特异的MAPK,功能上不能取代同类其他
的MAPKK,一套特异的功能上相连的三级激酶
形成一个MAPK通路的基本模块。
MAPK的
活性调节是可逆的(ChangandKarin,2001),
MAPK磷酸酶(MAPKphosphatase,MKP)可以
通过对MAPK的去磷酸化而使其失活。
MAPK既可以作为信号转导的一个环节继续磷
酸化下游的成分,又可以进入细胞核激活转录因
子进而调节基因表达。
MAPK是该级联途径中最后一个激酶,包
括一个三肽基序TXY,即ATP磷酸化位点,也
叫活性片段,此基序位于激酶催化结构域的第七
和第八亚结构域之间的活化环(T-loop)中。
MAPKK可通过保守的S/T-X3-5-S/T(S代表丝氨
酸,T代表苏氨酸)模块上的2个丝/苏氨酸残基
磷酸化而被活化,在酵母和哺乳动物中,中间X
(X代表氨基酸)的个数为3,而在植物中为5。
植
物中已经发现的MAPKKK有CTR1、EDR1、
NPK1/ANP和MEKK1-4(Favataetal.,1998),其
中CTR1和EDR1与动物中的Raf家族相关
(MAPKgroup,2002)。
MAPKKK自身可通过
中介桥梁因子(intermediatebridgingfactors)或者
互联MAPKKKK之后通过生理反应或/和受
体自身的磷酸化而活化(Jonaketal.,2002)。
G蛋白质(如Ras家族或异三聚体复合物)
也可以作为感受胞外刺激的膜受体和胞内
MAPK通路的偶联剂(Leeetal.,2001)。
此级联
途径的每一级都包括多个成员,此种多样性决定
于信号转导的特异性。
在同一细胞中存在着
多条MAPK通路,每条通路中的三级激酶与不
同的上游受体和下游目标物连接,纵横交错,形
成错综复杂的信号转导网络。
2MAPK的分类
2.1哺乳动物MAPK的分类
哺乳动物中的蛋白质激酶分为两大家族,
一族可磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸,另一族可磷
酸化酪氨酸。
这些激酶在整个动物界中表现
出高度的进化保守性,行使着很多重要的功能。
其中,丝/苏氨酸促分裂原活化激酶可以被许多
刺激物所活化。
根据生理遗传特性和氨基酸
保守的TXY基序序列比较,MAPK可分为4类:
胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated
kinase,ERK),其中X为E(谷氨酸);c-jun-氨基
末端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)或称为
胁迫激活蛋白质激酶(stress-activatedprotein
kinase,SAPK),其中X为P(脯氨酸);p38,其中
X为G(甘氨酸)(Campsetal.,1999;Bermanetal.,
2001)。
2.2植物MAPK的分类
植物中,拟南芥全基因组序列测定发现存
在21种MAPK,10种MAPKK,60种MAPKKK
(MAPKgroup,2002)。
他们将以上发现的激酶
与已经鉴定的其他植物(苜蓿、烟草、水稻和
大麦等)中的MAPK相关激酶放在一起,制订了
一套分类命名法。
目前已从高等植物中分离
出50余种MAPK基因,根据其中保守的TXY基
序内氨基酸序列比较,将其分成TEY和TDY2
个亚型,其中前者又包括A、B和C3个组,后2005陈娅斐等:
MAPK级联途径在植物信号转导中的研究进展359
者为D组。
A组的MAPK参与多种生物和非
生物胁迫以及激素反应,如AtSIPK可被损伤、
盐、渗透压和病原物衍生的激发子所诱导
(Jonaketal.,2002);B组的MAPK研究的较少,
但已证明了它们参与环境胁迫反应和细胞分裂,
比如拟南芥的AtMPK4可参加生物和非生物胁
迫应答;关于C组和D组的信息很有限,仅在微
型分析中检测到控制24小时生理节律的
AtMPK7表达。
根据MAPKK氨基酸线性排列
顺序比较,这10种MAPKK可以分在4个组
(A、B、C和D)中,其数量约为MAPK的一
半,所以不同的信号转导通路之间的“交谈”
(crosstalk)可能会集中在这个水平。
MAPKKK的成员较多,共分成3组(A、B和C)。
A
组含有典型的MAPKKK(如MEKK1/STE11/
BCK1)激酶结构域,B组和C组的氨基酸序列
与Raf激酶有关。
Jonak等(1999)的综述中列
表详细总结了MAPK级联途径中一些有代表
性的激酶的生物功能,在此不再赘述。
MAPKgroup(2002)提出的分类命名法给其
他物种中与MAPK有关的各种分子的分类和命
名提供了基础,即可以通过参考拟南芥中激酶序
列来推测相关植物中类似分子的作用,这为进一
步的研究提供了指导。
3MAPK级联反应的激发子
由于植物的固定性,它们必须通过调整自
身的代谢功能来适应逆境。
MAPK级联途径的
激活与微生物病原体感染、损伤、低温、干
旱、过高或过低的渗透压、盐、碰触和活性
氧等刺激性处理有关(Widmannetal.,1999;
DanglandJones,2001;Yangetal.,2001;Zhang
andKlessig,2001),以上因素都可以称为激发子
(elicitors),其中微生物产生的病原体激发子可分
为种族特异性的和非种族特异性的两种。
非
种族特异性激发子包括入侵微生物自身的各种
化合物,如真菌细胞壁碎片、细菌鞭毛蛋白质
(Gómez-Gómezetal.,2001)、寡糖、脂类、肽
类和蛋白质等(Montesanoetal.,2003),以上激
发子已知的受体均位于质膜上;种族特异性激
发子多是由病原体无毒基因(avirulence,Avr)编
码的蛋白质产物,受体为cf-9。
这些产物或者被分
泌入胞间空隙,或者通过第Ⅲ类型分泌系统直接注
入细胞。
以下介绍两例最近鉴定的激发子。
3.1Harpin
harpin是由一群植物病原菌欧氏杆菌属和
假单胞杆菌属等的第Ⅲ类型途径分泌的效应蛋
白质组成的。
harpin可导致感病植物的致病和
对非宿主植物和宿主植物抗性品种的过敏反应
(hypersensitivereaction,HR)。
研究发现,有些
效应蛋白质可以与植物胞内蛋白质相互作用,从
而活化植物体内的防御系统。
Lee等(2001)在
豆类中发现halo-blight病原菌丁香假单胞菌
(Pseudomonassyringaepv.phaselicola)产生的
harpin(harpinPsph)可结合于质膜上,这种结合具
有特异性、可逆性和饱和性。
它可以引起48
kD水杨酸响应的SIPK(salicylicacid-inducible
MAPK)的活化和与病程相关蛋白质HIN1的转
录积累。
他们发现包括SIPK在内的MAPK活
性对于harpinPsph引发的HIN1表达是必需的。
3.2鞭毛蛋白质(flagellin)
除了对于特殊病原物的识别系统外,植物
也发展出能识别相对于普遍微生物类群特征的
微生物成分识别系统。
不同的微生物结构可
以作为激发子而起作用。
对于一部分普遍的
激发子,已经鉴定出其存在于细胞质膜上的特定
结合位点。
特异的、高亲和性的结合位点的
鉴定和表征为理解植物识别这些微生物诱导物
的过程提供了重要信息。
Meindl等(2000)已经
鉴定出含有22个氨基酸残基的鞭毛蛋白质
FLG22,它在不同的植物细胞中都可作为抗性相
关反应的激发子。
Peck等(2001)发现经过
FLG22处理后,拟南芥中的识别蛋白质激酶FLS2
是一个编码富含亮氨酸重复结构(leucine-rich
repeat,LRR)的丝/苏氨酸激酶,同时Gómez-Gómez
等(2001)发现FLS2的磷酸化对于鞭毛蛋白质受36022(3)
体复合物正确的结合和信号传递是必要的。
植物识别到激发子之后,就开始启动一系
列信号转导事件,比如Ca
2+等离子的内流,活性
氧生成,激酶活化以及转录水平的一系列变化,
这些防卫机制在感知刺激几分钟之内就能发生
作用。
随后,在数小时内,病程相关(PR)蛋白(如
b-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等)、植保素和细胞
壁加固有关化合物(如富含羟脯氨酸的糖蛋白和
木质素等)的合成都会发生;同时,第二信使分子
如乙烯、茉莉酸和水杨酸也相继生成。
这些
抗性反应或是杀死病原物或是将其控制在一定
范围内(SamuelandEllis,2002;Yangetal.,2003)。
研究表明,不同的激发子可以引起共同的
MAPK应答。
Holley等(2003)研究了秘鲁番茄
(Lycopersiconperuvianum)悬浮细胞在多肽信
号分子系统素(systemin)、寡糖诱导子(ologosaccharideelicitors)和紫外线B的作用下,被诱导
出3个MAPK类似物,LeMAPK1~3,其中
LeMAPK1/2可以被以上3种激发子独立诱导,
LeMAPK3只能被紫外线B诱导。
激发子受体的鉴定是此类研究中的一项巨
大挑战,目前只鉴定出了少数特异性识别受体。
生物化学研究已经得到一些结合蛋白质的激发
子的特征,结合蛋白质可能是识别复合体的一部
分。
病原识别中最为可能的受体种类是跨膜
的受体样蛋白质激酶(receptor-likeprotein
kinases,RLKs)(Montesanoetal.,2003)。
4MAPK级联途径特异性的几种可
能机理
为实现正常的信号功能,MAPK级联途径
应该以高效性和高忠实性来进行信号传递。
然而,这种特异性的机理一直未被充分阐明。
最近有研究揭示了两种可能的机制调节信号传
递,即锚定反应(dockinginteraction)和搭架
(scaffolding)过程。
4.1锚定反应
此方面的研究结果在酵母和哺乳动物中较
为完整。
MAPK与其相应的MAPKK、底物
和磷酸酶共同构成一个复合体,这个复合体的形
成过程称为锚定反应(Montesanoetal.,2003)。
以下是一些对酶的晶体结构和序列分析得到的
结果,这些结构为推测MAPK级联途径的作用
机理提供了证据。
在与MAPK相互作用的分
子(如MAPKK、MKP和MAPKAPK)的一级结
构上发现了保守的MAPK锚定模体(docking
motif),它由疏水性氨基酸围绕的一个带正电的
氨基酸簇形成,但不在其催化反应结构域。
在
MAPK调节的转录因子(如Elk1、Sap1和Mef2)
中存在一个类似的区域称为D结构域。
MAPK
中的锚定位点称为通用锚定结构域(common
dockingdomain,CDdomain),它定位于MAPK
一级结构的C末端,由一簇带负电的氨基酸残
基组成,由于此位点在与激发子、抑制子和下
游底物的锚定反应中共用,故得名。
由于与
MAPK相互作用分子上的锚定模体带正电,而
MAPK中的通用锚定结构域带负电,所以推测
锚定反应实质为静电相互作用。
通用锚定结
构域与附近的ED位点及其临近氨基酸一起叫
做锚定沟。
MAPK与其他分子相互作用的特
异性不只是与通用锚定结构域有关,还有可能是
由这个锚定沟决定的。
使MAPK发生去磷酸
化而失活的MAPK磷酸酶(MKP)存在一个锚定
表面与MAPK的锚定沟相对应。
在MAPK的
底物(主要是指转录因子如Elk-1和Sap-1)上存
在着另一个保守模体FXFP(F代表苯丙氨酸,X
代表任意氨基酸,P代表脯氨酸),此模块的特点
是苯丙氨酸被一个氨基酸(X)所分隔,后面是一
个脯氨酸(TanoueandNishida,2003)。
对烟草中伤诱导蛋白激酶(wound-induced
proteinkinase,WIPK)的研究表明,WIPK与
NtMEK2作用的通用锚定结构域位于C-末端,
并且此结构域对于NtMEK2和WIPK的活化是
起关键作用的(Yangetal.,2003)。
4.2搭架过程
Xu等(1995)观察到即使在细胞中过表达2005陈娅斐等:
MAPK级联途径在植物信号转导中的研究进展361
MEKK1,使之组成性的活化,它也只能磷酸化并
激活MEKs,而不能将信号转导至下游的ERK。
根据类似的结果人们猜测在信号转导过程中,一
定有某种机制在调节酶-底物的亲和性方面起
作用。
作者认为所谓支架蛋白质或者接头蛋
白质(adaptor)是一类可以与酶和底物相互作用,
但不直接参加磷酸化反应的第三方分子,它可以
使酶-底物复合物的形成更加便利。
在酵母中,
蛋白质STE5通过将信息素应答的上游激发子
和MAPK级联的三组分组织成为一种特殊的
模式,起到了支架的作用,这种模式调节了两种
不同信号途径的特异性(Herskowitz,1995)。
对
哺乳动物中支架蛋白质类似物的研究表明
(Schaeffer,1998),哺乳动物中与JIP无关的一种
支架蛋白质MP1(MEKpartner1)能特异地结合
到ERK1和MEK1上,并且使二者更易活化。
在
悬浮细胞中过表达(overexpression)MP1,能提高
ERK的活性,同时活化一个由转录因子Elk-1驱
动的报告基因。
此过程中,MP1能促使ERK1
结合到MEK1上,使其活性潜能发挥出来。
5MAPK的研究方法
近年来在蛋白质激酶的研究过程中,研究
者们逐渐发展出一些比较成熟的方法。
5.1用MBP测定MAPK活性
近年来,多数测定动物或植物中MAPK活
性的方法都以髓磷脂碱性蛋白质MBP作为底
物(myelinbasicprotein,MBP)。
MBP是一族携
带正电荷、能促进髓鞘形成和折叠的蛋白质
(Atkinsetal.,1999)。
Miyamoto和Kakiuchi
(1975)在鼠脑中发现MBP,并且是磷蛋白磷酸酶
(phosphoproteinphosphatases)的底物。
Shanker和Pieringer(1987)在从鼠脑胚胎细胞中
分离得到的髓磷脂样膜组分中发现。
研究表
明,MBP是几种蛋白质激酶(蛋白质激酶C、
蛋白质激酶A、钙/钙调蛋白质依赖的蛋白
质激酶Ⅱ和MAPK等)的最适底物。
以MBP为底物的胶酶活性分析(ingel
MAPkactivityassay)的实验策略如下:
将MBP
与放射性标记的[r-
32
P]ATP加入MAPK(或蛋白
质提取物)中,用SDSloadingbuffer中止反应后
进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,然后用放
射自显影技术定量磷酸化的MBP(Guptaand
Luan,2003;Yangetal.,2001)。
基于类似的原
理,可以测定MEK的自磷酸化和磷酸化活性。
5.2激酶抑制剂(inhibitors)
MAPK级联途径的研究方法之一是使用其
抑制剂进行分析。
植物中应用较多的抑制剂
是PD98059和U0126。
通常证明某种代谢通路
或中间产物是否与MAPK级联途径相关的方法
是用特异性的抑制剂与MAPK或MEK等发生作
用,再检测其他代谢产物受到的影响,结果可作
为复杂信号转导网络信号之间相关性的证据。
在动物中,当前此方面的研究热点是p38
和MEK1/2蛋白质激酶的小分子抑制剂特性。
在动物疾病模型中,其中的一些抑制剂已经显示
出效果,并且已经发展到治疗炎症和癌症的临床
试验阶段(EnglishandCobb,2002)。
研究发现,
多数蛋白酶抑制剂与ATP有竞争性,人们相信它
们与ATP结合位点有相互作用。
但有研究表明,
MEK1/2的抑制剂不与底物ATP发生竞争
(Favataetal.,1998),这表明抑制机制并不单一依
赖激酶,它们只是把ATP作为磷酰基提供者。
因为蛋白质激酶的种类繁多,其抑制剂的
特异性成为该领域研究的一个热点。
抑制剂
结合结构分析设计阻断剂的发展表明,其特异
性将通过模型化和以结构为基础的设计得到提
高。
抗炎剂吡啶异咪哒唑类(pyridinylimidazole)化合物(Wilsonetal.,1996),比如VK19911及
SB类化合物(smithklinebeecham,SB)(Shanker
andPieringer,1987),都是p38的高效和高选择性
抑制剂,它们对于与之紧密相关的ERK2或其他
丝/苏氨酸激酶无此作用。
晶体结构数据表明,
SB类化合物可与p38低活性形式的开放区域结
构互补,并结合于其活性位点的伸展口袋
(extendedpocket)上,而相对关闭的ERK2结合36222(3)
区域只能容得下较小的分子olomoucine[一种较
好的ERK2抑制剂(Wangetal.,1998)]。
MEK1/2的第一个合成的抑制剂是
PD98059,它是在有ERK活性的抑制剂的体外筛
选中被鉴定出的(Dudleyetal.,1995)。
不久在
佛波酯诱导的细胞活性蛋白质1(AP-1)的活性筛
选中发现了第二个抑制剂U0126。
这两个抑制
剂都与ATP无竞争性,似乎都结合于MEK1上
相似的位点(Favataetal.,1998)。
但目前对于如
何设计真正基于此种类型的抑制剂的策略还知
之甚少,所以大量化合物的高通量筛选仍是最有
希望的方法之一(Halazy,2003)。
5.3免疫沉淀法
大分子蛋白质是一种完全抗原,具有免疫
原性和特异反应性,即它不仅能免疫机体并促使
机体产生抗体,还能与抗体产生特异性结合。
抗原-抗体反应可能是生物体中已知的最特异的
反应(于善谦等,1999)。
在确定MAPK级联途径
中有关激酶的种类时,特别是在与其余相似的激
酶进行区分时,免疫沉淀法是一种微量、灵敏和
特异性强的检测方法,得到了广泛的应用。
MAPK特异性抗体是通过识别双磷酸化的
苏氨酸-谷氨酸-酪氨酸三肽模体pTEpY而发生
免疫结合的。
使用某种MAPK的一段特异性
序列制备的单一特异性抗血清(mono-specific
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