平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究.docx
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平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究
平白术多糖与氨基酸提取及含量测定研究
【摘要】目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据,分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸,并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。
方法采用L9实验因素设计实验,苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。
以茚三酮为衍生试剂,采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。
结果平白术多糖的含量为%。
平白术中至少含有17种氨基酸,总氨基酸含量为mg·g-1。
结论方法简单、有效、快速、准确、灵敏,适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。
【关键词】平白术;多糖;氨基酸
Abstract:
ObjectiveToextractpolysaccharideandaminoacid anddeterminetheircontentsinordertoofferthebasisforusingAtractylodesmacrocephalaKoidzfromPingjiang.MethodsUsingL9orthogonaltest,PhenolsulfuricmethodwasusedtotestpolysaccharidecontentinAtractylodesmacrocephalaandtoassayaminoacidusingmethodofNinhydrinpost-columnderivation.ResultsTheanalysisofAtractylodesmacrocephalaKoidzshowedthatthecontentofpolysaccharidewas%andtherewereatleast17kindsofaminoacids,thetotalcontentwas mg·establishedmethodisquitesuitableforidentificationandquantificationofpolysaccharideandaminoacidsinAtractylodesmacrocephala issimple,effective,rapid,accurateandsensitive.
Keywords:
AtractylodesmacrocephalaKoidz;Polysaccharide;Aminoacid
白术是传统中药,《中国药典》收载的白术为菊科植物AtractylodesmacrocephalaKoidz的干燥根茎,白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效[1]。
《中国药典》2005年版第一部记载含白术的处方有91个。
近几年以来,中国对白术的需求量大增,居全国大宗常用中药材之首。
由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注,使白术的临床应用日趋广泛[2],其研究也更为深入、更为多元化。
然而,迄今为止,对白术中营养成分氨基酸研究甚少。
为了开发利用白术的药用价值,本文对湖南平江产白术——平白术进行研究,提取平白术多糖、氨基酸,采用正交实验选择多糖显色条件,用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
以茚三酮作衍生试剂,采用柱后衍生法测定氨基酸含量。
1材料
仪器
UV2150型分光广度计,日立L8800全自动氨基酸自动分析仪
试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。
三钠、醋酸钠,平江白术、果糖标准品、氨基酸标准品。
2方法与结果
显色条件的考察
苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液1ml于10ml具塞试管中,精密加入1ml不同浓度的苯酚和5ml浓硫酸,混匀,放置5min。
移入25℃的水浴中保温20min。
冷却。
以蒸馏水1ml加相应的试剂作空白,测定吸收度。
见图1,表1。
表1苯酚浓度的考察
实验结果表明,苯酚浓度在4%~7%范围内所得吸收值相近,苯酚浓度为5%时所得吸收值较大,故选择苯酚浓度为5%。
苯酚-硫酸法正交实验设计[3]实验因素水平表设计:
实验选择苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间4个因素作为考察对象,根据初步实验,每个因素确定3个水平,采用L9正交表进行实验。
以吸收度为评价指标。
对结果进行统计学处理,得方差分析见表4。
表2实验因素水平表3L9正交实验结果表4方差分析
经方差分析可知,苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显着,但综合比较,本实验选择苯酚-硫酸法最佳显色条件为A3B1C3D2即苯酚ml,浓硫酸4ml,水浴温度25℃,水浴放置时间30min。
测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中,加水溶解,定量转移至100ml量瓶中,加水至刻度,混匀。
吸取该样品2ml于试管中,加5%苯酚水溶液ml混匀,迅速加入4ml浓硫酸,振摇10min,在25℃水浴保温放置30min,取出冷却,以苯酚-硫酸溶液为空白,于400~800nm范围扫描,选择最大吸收波长nm为测定波长。
标准曲线精密称取105℃干燥至恒重的标准果糖mg,加水溶解至250ml,配成μg/ml的标准储备液。
取10ml具塞试管,分别加上述标准液,,,,,,,ml,加水稀释至1ml,摇匀,每个试管各加5%苯酚水溶液ml混匀,再迅速加入4ml浓硫酸,振摇10min,在25℃水浴保温放置30min。
以水作空白在nm处测定各标准液的吸收度,得回归方程A=3C+6。
其在1~μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
换算因素测定精密称取干燥的平白术多糖20mg,用蒸馏水溶解后定容至100ml,作为多糖储备液。
精确量取多糖储备液ml,加水至ml,按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。
按下式计算换算因素:
f=W/CD,试中:
W为多糖质量,C为多糖液中果糖的浓度,D为多糖的稀释因素,测得f=。
平白术多糖、氨基酸的提取
平白术多糖的提取[4]精密称取白术粗粉50g置于1000ml的容量瓶中,加6倍量70%的乙醇回流2h。
过滤,取滤渣加8倍蒸馏水回流2h,趁热过滤。
在滤渣中加6倍水回流1h,趁热过滤。
再在滤渣中加3倍量水回流1h,趁热过滤,合并3次滤液,浓缩至100ml,加无水乙醇至乙醇浓度达85%,再用75%乙醇冲洗,离心,反复6次,去溶液取沉淀。
加水溶解,用5%ZnSO44ml和饱和Ba2溶液16ml振摇,离心去蛋白,反复10次[5]。
将所得溶液置于冰箱中过夜,次日取出溶解,在8000r/min离心15min,反复4次。
用氯仿-正丁醇与溶液按5∶1的比例混合搅拌15min,离心,反复3次,得澄清液即白术多糖溶液。
加水至100ml冷藏备用。
平白术氨基酸的提取称取平白术粉末40g投入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中,加入6mol/L的盐酸100ml,加热水解24h,反应温度保持在(110±1)℃左右。
滤渣用少量稀盐酸浸泡,过滤,重复两次,收集3次滤液得水解液,加热7h赶盐酸。
在滤液中加入g活性碳且维持滤液在(80~90)℃,磁力搅拌脱色30min,重复2次,减压浓缩得到50ml橙红色的溶液,作为储备液。
于4℃的冰箱中保存。
平白术多糖和氨基酸含量的测定
样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后,精密吸取ml,按照标准曲线的方法测定吸光度,计算平白术多糖的含量。
按下式计算多糖含量:
多糖含量=CDfW×100%,式中
W为多糖质量,C为多糖液中果糖的浓度,D为多糖的稀释因素,f为换算因素。
测得多糖的含量为%。
回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准液,按项下操作,并适当稀释,以样品液为空白,测定吸收度,计算回收率。
平均回收率为%,RSD=%。
结果如表5。
表5回收率实验结果
稳定性实验取样品在8h内测定吸收度,1次/h。
样品在4h内稳定,RSD=%。
平白术氨基酸的测定条件[6]
实验条件:
L-8800型全自动氨基酸分析仪,钠型阳离子交换柱,分析时间35min,流动相柠檬酸三钠缓冲液,四元梯度洗脱,缓冲液流速ml/min,茚三酮流速ml/min,缓冲液泵压力8~Pa,茚三酮泵压力~kPa,柱温50℃,氮气压力20kPa。
柱的衍生条件:
反应液A:
390g茚三酮/L丙二醇甲醚,反应液B:
醋酸钠/醋酸:
丙二醇甲醚;供试品和对照品溶液进样量均为20μl。
平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件,使用日立L-8800AAA分析仪进行样品测定。
分离得到的氨基酸谱图如图2~3。
样品中氨基酸的含量结果见表6。
表6平白术中氨基酸含量测定结果
3讨论
本实验采用75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后,再用水提醇沉法制得白术多糖。
在采用Sevag法去蛋白至少重复6~7次,才能基本上除去蛋白,且多糖损失率也较大。
本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后,再加冷冻-Sevag法除蛋白,去蛋白比较彻底。
在进行乙醇沉淀时,85%的乙醇浓度已能将多糖基本沉淀出来,增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显着。
多糖采用真空干燥法,可避免加热干燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。
氨基酸是构成生物体蛋白质分子的基本单位,与生物的生命活动密切相关,尤其与人类健康有着紧密的关系。
本分析结果表明,平白术氨基酸至少含有17种氨基酸,总含量为mg·g-1。
必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用,缺一不可,否则可引起生理功能异常,导致疾病。
总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸,并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等4种半必需氨基酸。
必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占%,%。
在水解氨基酸时,温度应严格控制在℃,水解24h,才能使蛋白质完全水解。
本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准,为开发利用平江白术提供了理论依据。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:
化学工业出版社,2000:
77.
[2]刘思贞,邵玉芹,祝希娴.白术药理研究进展[J].时珍国医国药,1999,10:
634.
[3]张维杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:
上海科学出版社,1987:
6.
[4]张立,马琼,何永利,等.灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定[J].中草药,2004,35:
167.
[5]陈柳蓉,邵青,陆蕴.白术及炮制品的多糖含量测定[J].中草药,1997,28:
214.
[6]杨文军,李德发,王若军,等.离子交换色谱OPA柱后衍生法测定饲料中胱氨酸和蛋氨酸的含量[J].中国畜牧杂志,2000,36:
26.
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