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分子生物学论文

题目：

PCR技术

摘要：

PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。

它的出现极推动了分子生物学的发

展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。

关键词：

PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用

PCR技术

一、概念：

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是体外扩增DNA序列的技术。

它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。

在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。

PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。

PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。

二、基本原理

（一）PCR技术的基本原理：

该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。

在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

PCR反应的基本成分包括：

模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的高温变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（二）PCR的反应动力学：

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

（三）PCR扩增产物：

可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。

短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。

引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以、形成长短一致的“短产物片段”。

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

（四）标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul

PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

酶及其浓度：

目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

催化一典型的PCR反应约需酶量2。

5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度：

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

模板（靶基因）核酸：

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

Mg2+浓度：

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。

三、PCR技术发展简史

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。

20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。

但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。

Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。

但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。

从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。

1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。

尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。

也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。

在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：

它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。

到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。

四、PCR技术的操作

（一）PCR的基本成分PCR包括7种基本成分：

模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。

模板DNA：

包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。

除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。

特异性引物：

是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。

热稳定DNA聚合酶：

这是PCR技术实现自动化的关键。

热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：

一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。

现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。

脱氧核苷三磷酸（dNTP）：

是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。

二价阳离子：

常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。

缓冲液：

一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。

一价阳离子：

一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。

（二）PCR的基本操作

PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。

PCR技术的基本反应由三个步骤组成：

1.变性：

通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2.退火：

将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3.延伸：

将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。

以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。

（三）PCR操作中的注意和要求1、污染的预防

进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的

PCR污染或杜绝污染的出现。

（1）划分操作区：

目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要验操作在三个不同的区域进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区进行：

标本处理区，包括扩增摸板的制备；

PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；

产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。

如：

标本制备→PCR扩增?

产物分析?

产物处理。

切记：

产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

2、环境污染：

在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。

环境污染中常见的污染源主要有：

（1）模板提取时真空抽干装置；

（2）凝胶电泳加样器；

（3）电泳装置；

（4）紫外分析仪；

（5）切胶用刀或手术刀片；

（6）离心机；

（7）冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。

用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。

（8）气溶胶。

如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。

（三）．污染处理

1、环境污染

（1）稀酸处理法：

对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡使残余DNA脱嘌呤；

（2）紫外照射（UV）法：

紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。

需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。

UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。

形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。

在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链的交联和DNA断裂等）均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。

这些位点的数量与二聚体位点相当。

如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。

相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。

这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。

2反应液污染

可采用下列方法之一处理：

（1）DNaseI法：

PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；

（2）切酶法：

选择识别4个碱基的切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR；

（3）紫外照射法：

未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；

（4）g射线辐射法：

五、PCR的主要应用

最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。

因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落过Southernblot杂交筛选含有靶基因的克隆。

这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。

自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。

为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。

（一）基础研究方面的应用

目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。

因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：

扩增目的基因和鉴定重组子；克隆基因；基因功能和表达调控的研究；基因组测序；制备单链模板；致突变；

（二）PCR在临床上的应用

1、在遗传学上的应用：

人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。

例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。

PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。

2、在肿瘤研究中的应用：

PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。

例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。

另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。

此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。

检测病原体3、在基因分型中的应用：

当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequencespecificoilgonucleotidepolymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。

此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。

（三）在法医学中的应用

例如：

最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。

目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。

使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。

除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variablenumbertandemrepeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。

所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。

在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。

PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。

可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。

21世纪是生物工程的世纪。

我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。

参考文献

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实验技术方法

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课件资源作者：

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自然科学