慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c.docx
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慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c
慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c
【摘要】 目的探讨慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达,以探讨老年抑郁症的发病机制。
方法将20只Wistar老年大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只。
实验组大鼠每天强迫游泳20min,并每周给予电刺激和强光照射各1次,经过21天应激制作老年大鼠慢性应激抑郁模型,对照组正常喂养,不给予上述处理。
采用特异性抗体标记的免疫组织化学方法,检测实验21天后老年大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达情况,并观察大鼠开场行为和排便情况。
结果实验组老年大鼠中央格停留时间延长,水平穿越格数减少,修饰行为减少,排便次数增多,c-fos平均灰度值:
实验组±vs对照组±,阳性细胞数:
实验组±vs对照组±,caspase-3平均灰度值:
实验组±vs对照组±,阳性细胞数:
实验组±vs对照组±。
结论慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白表达增加,行为表现异常,可能与慢性应激所致细胞凋亡增强、海马区脑组织损伤有关。
【关键词】慢性应激;抑郁;c-fos蛋白;caspase-3;行为
【Abstract】ObjectiveToobservetheexpressionofc-fosandcaspase-3proteiningeriatricratshippocampusCA3areainducedbychronicunpredictablemildstressinordertounderstandthenosogenesisofdepression.Methods20geraticWistarratswererandomizedlydividedintoexperimentalgroupandcontrolgroup,10ratsforeach.Inexperimentalgroup,ratswereforcedtoswim20minuteseachdaypluselectricitystimulationonceaweek,incontrolgroup,nospecialinterventionwereadded.After21days,theexpressionofc-fosandcaspase-3proteinweredetectedbyimmunohistochemistrymarkedbyspecialantibodies,meanwhile,theopen-fieldbehavioranddefecationconditionbeforeandafterexperimentwereobserved.ResultsInexperimentalgroup,geriatricratsshowedprolongedimmobilitytime,ambulationandmodificationtimedecreased,fecesincreased;c-fosmeangrayscale:
±vs±,positivecellnumber:
±vs±;caspase-3meangrayscale:
±vs±,positivecellnumber:
±vs±.ConclusionTheexpressionofc-fosandcaspase3proteinincreasedinhippocampusCA3areaofgeriatricratsinducedbychronicunpredictablemildstress,behaviorshowedabnormal,whichmightberelatedtotheaugmentofcellapoptosisandthebraindamageinhippocampusinducedbychronicstress.
【Keywords】chronicstress;depression;c-fosprotein;caspase-3;behavior
随着我国逐步步入老龄化社会,老年人抑郁症发病率有逐年升高的趋势,并引发系列社会问题[1],一般认为抑郁症为功能性精神障碍,但利用CT、MRI等影像技术手段,发现抑郁症并非完全功能性疾病,抑郁症患者海马区存在与慢性应激大鼠相似的形态改变,如海马神经元丧失、海马体积减小等变化[2]。
神经元缺失一般有凋亡和坏死两种机制,究竟是哪种机制起作用抑或是两种机制共同作用目前还不清楚。
c-fos是一种原癌基因,当机体受损害性刺激时即表达c-fos蛋白,但在慢性抑郁症时c-fos蛋白表达是否异常尚无定论。
近年来的研究发现,caspase家族是大多数细胞凋亡发生的共同途径,实验提示,caspase的抑制可阻断β淀粉多肽诱导的神经元凋亡,提示caspase家族在抑郁发病中可能起重要作用[3]。
Katz等[4]利用大鼠连续3周处于应激状态制作慢性应激所致抑郁动物模型,具有较高的应用价值,该研究采用慢性应激模型,观察老年大鼠海马区c-fos和caspase家族代表性成员caspase-3蛋白的表达,以了解二者的变化情况,进一步揭示老年抑郁症的发病机制。
1材料与方法
实验动物老年Wistar大鼠,雄性,12月龄以上,体重350±50g,SPF级,共20只,由武汉大学实验动物中心提供。
试验动物生产许可证号:
SCXK(鄂)2003-2004,实验动物使用许可证号:
SYXK(鄂)2003-2013,动物实验-SPF级,繁殖供应-SPF级。
动物分组将老年大鼠置于昼夜节律光照条件下,自由进食饮水,室温控制在18℃~20℃,饲养7天以使动物适应环境,1周后进行开场行为测定并称重,行为评定由课题组两位成员同时进行,盲法评定,然后取平均值,根据计算器产生一组随机数,依随机数将大鼠分为实验组和对照组,每组10只,实验组动物每笼1只,对照组每笼5只,实验开始前评价两组动物开场行为和体重,各指标间差异无显着性,见表1。
表1大鼠开场行为分析及体重测定结果注:
各组间实验前后比较,*,**;实验组与对照组实验后比较,△△
老年大鼠慢性应激抑郁模型的制作每天强迫大鼠游泳,将大鼠置于一800mm×500mm×400mm的整理箱中,水温保持15~20℃,每次游泳20min,共21天,其间每周并给予电击足底刺激、夹尾1min1次,禁食48h1次,对照组则不给予上述处理,自由进食饮水。
主要设备HPIAS-2000型彩色图像分析仪(同济千屏影像工程公司软件),LeicaRM2145轮转式切片机。
主要试剂兔抗大鼠c-fos多克隆抗体;兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体;SP试剂盒。
动物处理于实验结束后1天,再次进行开场行为测定并称重,然后用戊巴比妥快速麻醉动物,开胸,经左心室快速灌注37℃生理盐水约200ml,再灌注中性甲醛200~300ml,断头,取脑组织修块,置于10%中性福尔马林溶液中固定。
常规石蜡切片(厚4~5μm)HE染色染色结果:
普通光镜下可见,细胞核呈蓝色,细胞质呈淡红色。
x【摘要】 目的探讨慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达,以探讨老年抑郁症的发病机制。
方法将20只Wistar老年大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只。
实验组大鼠每天强迫游泳20min,并每周给予电刺激和强光照射各1次,经过21天应激制作老年大鼠慢性应激抑郁模型,对照组正常喂养,不给予上述处理。
采用特异性抗体标记的免疫组织化学方法,检测实验21天后老年大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白的表达情况,并观察大鼠开场行为和排便情况。
结果实验组老年大鼠中央格停留时间延长,水平穿越格数减少,修饰行为减少,排便次数增多,c-fos平均灰度值:
实验组±vs对照组±,阳性细胞数:
实验组±vs对照组±,caspase-3平均灰度值:
实验组±vs对照组±,阳性细胞数:
实验组±vs对照组±。
结论慢性应激老年抑郁大鼠海马CA3区c-fos和caspase-3蛋白表达增加,行为表现异常,可能与慢性应激所致细胞凋亡增强、海马区脑组织损伤有关。
【关键词】慢性应激;抑郁;c-fos蛋白;caspase-3;行为
Expressionofc-fosandcaspase-3proteiningeriatricratshippocampusCA3areainducedbychronicstress
ZHANGHong-wei,HOUAn-ji,HUYan,etal.DepartmentofGeriatricsandOncology,ShanghaiNo7People’sHospital,Shanghai200137,China
【Abstract】ObjectiveToobservetheexpressionofc-fosandcaspase-3proteiningeriatricratshippocampusCA3areainducedbychronicunpredictablemildstressinordertounderstandthenosogenesisofdepression.Methods20geraticWistarratswererandomizedlydividedintoexperimentalgroupandcontrolgroup,10ratsforeach.Inexperimentalgroup,ratswereforcedtoswim20minuteseachdaypluselectricitystimulationonceaweek,incontrolgroup,nospecialinterventionwereadded.After21days,theexpressionofc-fosandcaspase-3proteinweredetectedbyimmunohistochemistrymarkedbyspecialantibodies,meanwhile,theopen-fieldbehavioranddefecationconditionbeforeandafterexperimentwereobserved.ResultsInexperimentalgroup,geriatricratsshowedprolongedimmobilitytime,ambulationandmodificationtimedecreased,fecesincreased;c-fosmeangrayscale:
±vs±,positivecellnumber:
±vs±;caspase-3meangrayscale:
±vs±,positivecellnumber:
±vs±.ConclusionTheexpressionofc-fosandcaspase3proteinincreasedinhippocampusCA3areaofgeriatricratsinducedbychronicunpredictablemildstress,behaviorshowedabnormal,whichmightberelatedtotheaugmentofcellapoptosisandthebraindamageinhippocampusinducedbychronicstress.
【Keywords】chronicstress;depression;c-fosprotein;caspase-3;behavior
随着我国逐步步入老龄化社会,老年人抑郁症发病率有逐年升高的趋势,并引发系列社会问题[1],一般认为抑郁症为功能性精神障碍,但利用CT、MRI等影像技术手段,发现抑郁症并非完全功能性疾病,抑郁症患者海马区存在与慢性应激大鼠相似的形态改变,如海马神经元丧失、海马体积减小等变化[2]。
神经元缺失一般有凋亡和坏死两种机制,究竟是哪种机制起作用抑或是两种机制共同作用目前还不清楚。
c-fos是一种原癌基因,当机体受损害性刺激时即表达c-fos蛋白,但在慢性抑郁症时c-fos蛋白表达是否异常尚无定论。
近年来的研究发现,caspase家族是大多数细胞凋亡发生的共同途径,实验提示,caspase的抑制可阻断β淀粉多肽诱导的神经元凋亡,提示caspase家族在抑郁发病中可能起重要作用[3]。
Katz等[4]利用大鼠连续3周处于应激状态制作慢性应激所致抑郁动物模型,具有较高的应用价值,该研究采用慢性应激模型,观察老年大鼠海马区c-fos和caspase家族代表性成员caspase-3蛋白的表达,以了解二者的变化情况,进一步揭示老年抑郁症的发病机制。
1材料与方法
实验动物老年Wistar大鼠,雄性,12月龄以上,体重350±50g,SPF级,共20只,由武汉大学实验动物中心提供。
试验动物生产许可证号:
SCXK(鄂)2003-2004,实验动物使用许可证号:
SYXK(鄂)2003-2013,动物实验-SPF级,繁殖供应-SPF级。
动物分组将老年大鼠置于昼夜节律光照条件下,自由进食饮水,室温控制在18℃~20℃,饲养7天以使动物适应环境,1周后进行开场行为测定并称重,行为评定由课题组两位成员同时进行,盲法评定,然后取平均值,根据计算器产生一组随机数,依随机数将大鼠分为实验组和对照组,每组10只,实验组动物每笼1只,对照组每笼5只,实验开始前评价两组动物开场行为和体重,各指标间差异无显着性,见表1。
表1大鼠开场行为分析及体重测定结果注:
各组间实验前后比较,*,**;实验组与对照组实验后比较,△△
老年大鼠慢性应激抑郁模型的制作每天强迫大鼠游泳,将大鼠置于一800mm×500mm×400mm的整理箱中,水温保持15~20℃,每次游泳20min,共21天,其间每周并给予电击足底刺激、夹尾1min1次,禁食48h1次,对照组则不给予上述处理,自由进食饮水。
主要设备HPIAS-2000型彩色图像分析仪(同济千屏影像工程公司软件),LeicaRM2145轮转式切片机。
主要试剂兔抗大鼠c-fos多克隆抗体;兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体;SP试剂盒。
动物处理于实验结束后1天,再次进行开场行为测定并称重,然后用戊巴比妥快速麻醉动物,开胸,经左心室快速灌注37℃生理盐水约200ml,再灌注中性甲醛200~300ml,断头,取脑组织修块,置于10%中性福尔马林溶液中固定。
常规石蜡切片(厚4~5μm)HE染色染色结果:
普通光镜下可见,细胞核呈蓝色,细胞质呈淡红色。
免疫组化染色[5]切片脱蜡入水,蒸馏水洗2次×3min;用pH柠檬酸缓冲液抗原修复,微波处理,解冻档5~6min;滴加3%H2O2,37℃,10min;滴加血清封闭,37℃,15min;滴加一抗,37℃,2h;PBS洗3次×3min;滴加生物素化的羊抗兔IgG,37℃,20min;PBS洗3次×3min;滴加标有辣根过氧化物酶的链酶亲和素,37℃,20min;PBS洗3次×3min;DAB显色;苏木素复染核;中性树胶封片。
同时用已知的阳性切片做阳性对照,以PBS取代一抗做阴性空白对照。
光镜下观察,c-fos阳性表达神经元为胞核呈棕黄色,核仁不着色;caspase-3阳性表达神经元为胞浆和胞膜呈棕黄色。
图像分析采用图像分析仪,每张切片选取海马CA3区四周及中央区域,200倍镜下测定其c-fos和caspase-3蛋白的阳性细胞数,平均灰度值等指标,各取平均值作为这张切片的值。
由同一人用同一台仪器测定。
统计学处理采用SPSS 统计软件包进行分析,结果以均数±标准差表示,组间检验采用t检验。
2结果
体重和开场行为评定见表1。
从表1可以看出,实验组与对照组实验前开场行为和体重差异无显着性(),实验组实验前和实验后开场行为中,除粪便粒数外,各指标差异有显着或非常显着性(或),体重也较实验前减轻();对照组实验前后开场行为也有部分改变(或),体重较实验前增加();实验组与对照组于实验后比较,除修饰次数差异无显着性,其余各指标对照组都优于实验组(或)。
c-fos和caspase-3蛋白的图像分析结果见表2。
从表2可见,c-fos蛋白的图像分析结果中,平均灰度值两组比较差异有非常显着性,两组阳性单位数比较,P=,说明实验组与对照组在c-fos的表达上存在明显的差异。
caspase-3的图像分析结果中,平均灰度值和阳性细胞数实验组与对照组差异均有极显着性,说明慢性应激老年大鼠c-fos、caspase-3蛋白表达较正常对照组有显着增强。
表2c-fos和caspase-3蛋白的图像分析结果注:
与对照组比较,P=。
c-fos、caspase-3蛋白免疫组化染色见图1~8。
图1~4为实验组和对照组c-fos蛋白免疫组化光镜照片,以胞核内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞,结果可见,在相同观察条件下,实验组阳性细胞数较对照组显着增多,提示慢性应激状态下老年大鼠c-fos蛋白表达较正常组有明显增强。
图5~8为实验组和对照组caspase-3免疫组化光镜照片,以胞浆内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞,在相同观察条件下,可见实验组阳性细胞数较对照组显着增多,同样提示慢性应激老年大鼠海马CA3区caspase-3蛋白表达活跃。
3讨论
慢性应激能导致抑郁症发病,已经多数研究得到证实,然而对于其发病机制尚存在不同观点,一般认为,在慢性应激过程中,多种神经元保护机制的缺失,神经元细胞凋亡的活跃,是导致大脑器质性损害的主要原因[6],老年人由于身体机能下降,抗损害能力也相应下降,细胞凋亡增加,对慢性应激的耐受更差,因此,探讨慢性应激所致细胞凋亡与抑郁症发病的关系,对于从细胞凋亡角度防治老年抑郁症具有重要作用。
利用强迫老年大鼠游泳和不可预见性中等强度刺激,经21天后,实验组大鼠行为学发生明显变化:
实验组大鼠中央格停留时间延长,水平穿越格数减少,修饰行为减少,排便次数增多,对实验前、后动物开场行为进行评定,结果实验前实验组与对照组差异无显着性,实验后两组动物行为差异有显着性,说明该种动物模型的制作是成功的。
实验同时发现,对照组大鼠在实验前后行为学上也发生了一些改变,如中央格停留时间、水平穿越格数、修饰行为等等,可能与经过21天实验,老年大鼠对环境新鲜感和满意程度都有所减退,且与实验对象本身为老年大鼠,随着年龄增加,运动功能有所减退有关,但粪便粒数无显着变化,体重有所增加,又说明老年大鼠认知能力和紧张程度无明显变化。
caspases即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶,caspase的超表达和激活可导致细胞凋亡的发生,因此caspase又被称为死亡蛋白酶,其中caspase-3是介导细胞凋亡的核心蛋白酶[7~8];c-fos蛋白的表达与机体受到的损害刺激有关,研究显示,当机体遭受疼痛、缺氧、寒冷等刺激时,激活相关部位的痛感受性神经元,c-fos原癌基因启动,c-fos蛋白的表达增加,启动caspase级联反应,最终激活caspase-3,导致细胞凋亡[9~11]。
本实验结果发现,经21天慢性刺激的老年大鼠,其大脑海马区c-fos和caspase-3蛋白的表达均显着增强,表明慢性刺激导致了c-fos原癌基因启动并通过级联效应导致caspase-3的高表达,从而导致脑细胞凋亡,提示细胞凋亡增加在抑郁症发病中起一定作用。
该研究为选用抗caspase和抑制原癌基因药物治疗老年抑郁症提供了一些实验依据,然而,这一结果还只是初步的,需要进一步的研究证实。
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