生物化学分子生物学经典实验技术.docx
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生物化学分子生物学经典实验技术
PCR
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌(Thermusaquaticus)分离出来的。
它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的,Dr.Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式表了第一篇相关的论文。
此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。
因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
PCR步骤
标准的PCR过程分为三步:
1.DNA变性(90℃-96℃):
双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
2.退火(25℃-65℃):
系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):
在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。
荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。
电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。
但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。
近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势
PCR反应特点
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
双向电泳
双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis)
是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
双向电泳完整的操作步骤
(一)第一向等电聚焦
1.从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。
2.在小管中加入0.01gDTT,Bio-Lyte4-6、5-7各2.5ml,充分混匀。
双向电泳图谱
3.从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。
4.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cmpH4-7),室温中放置10分钟。
5.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。
注意:
不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
双向电泳槽
6.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
7.分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。
8.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9.对好正、负极,盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
10.聚焦结束的胶条。
立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。
(二)第二向SDS-PAGE电泳
1.配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。
配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水(没有milliq的话ddh2o也行,注,水云深浪按)、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。
聚合30分钟。
一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。
2.待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。
3. 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。
4.配制胶条平衡缓冲液I。
5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。
这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6.将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。
将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7.配制胶条平衡缓冲液II。
8.第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。
并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。
将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。
10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11.将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。
赶去缓冲液表面的气泡。
12.第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。
并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。
13.将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。
然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
其余胶条同样操作。
14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。
在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15.用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。
注意不要在胶条下方产生任何气泡。
在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。
16.放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。
将凝胶转移至电泳槽中。
18.在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。
20.进行染色。
酵母双杂交
(一)基本原理
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i。
典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:
DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。
前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。
主要有二类载体:
a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence),而GAL4-ad没有。
因此,在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用binding-domain基因有:
GAL4(1-147);LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
常用的activating-domain基因有:
GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:
〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd,LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad,VP16)。
激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。
主要是由于:
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
(二)酵母双杂交系统的应用
1特点与优点
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:
⑴作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。
2结构组成
酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。
利用此系统已分析和测定了多种重要结构域,如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v,p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cellnuclearantigen,PCNA)的结合序列vi等。
此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域,绘制蛋白质联系图谱,在药物设计等许多方面。
(三)酵母双杂交系统局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法,有多方面的应用,但仍存在一些局限性。
⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展,。
例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生;发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。
其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:
⑴用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因,可明显减少假阳性。
⑵通过营养型筛选增强了筛选能力,尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统viii也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。
在此系统中,一种感性趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白,另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。
表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体(CAT)共同转染哺乳动物细胞系。
报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。
假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。
用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用,得到了酵母双杂交系统相同的结果。
且较酵母双杂交系统更为快速,在转染48h内得到结果。
并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。
因而,哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段
酵母双杂交系统建立的基础
酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统的组成
•与BD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)
•与AD融合的蛋白表达载体,表达的蛋白称靶蛋白(prey或fish)
•带报告基因(reportgene)的宿主细胞
噬菌体展示
噬菌体展示技术是1种将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。
将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后,以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面,被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。
用抗体、受体、核酸、以及某些碳水化合物可以从噬菌体随机肽库中筛选出与之结合的肽段,因此在抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物的开发研究方面有广泛的应用前景。
该技术实现了表型与基因型的统一。
随着噬菌体展示技术的进一步发展,其优越性被越来越多的实验室所认识,使得该技术的使用范围不断扩展,也使该技术得以不断的完善和发展。
展示系统分为:
丝状噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统、T4噬菌体与lamda噬菌体展示系统
所展示内容包括:
随机肽段、天然肽段、cDNA、抗体、抗体片段等等
筛选方式包括体外筛选和体内筛选
RNA干扰
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
近几年来RNAi研究取得了突破性进展,被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。
由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。
RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式,是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。
RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。
RNAi具有生物催化反应特征,反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。
RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。
1 RNAi的发现
RNAi是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA(antisenseRNA)的过程中发现的,由dsRNA介导的同源RNA降解过程。
1995年,Guo等发现注射正义RNA(senseRNA)和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达,该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。
直到1998年,Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发,并将这一现象命名为RNAi。
此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中,并逐渐证实植物中的转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。
1999年,Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。
2000年,Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现,外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)引发RNAi。
2000年,Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。
2001年,Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependentproteinkinase,PKR)和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase,2',5'-OAS)信号转导途径的同时,有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。
2002年,Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA(smallhairpinRNA,shRNA)表达载体pSUPER,并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达,为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。
2 RNAi的应用
2.1 RNAi在探索基因功能中的应用:
人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。
阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。
在RNAi技术出现以前,基因敲除(geneknockout)是主要的反向遗传学(reversegenetics)研究手段,但其技术难度较高、操作复杂、周期长。
由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达,所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。
同时siRNA表达文库构建方法的建立,使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能,对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。
2.2 RNAi在基因治疗领域中的应用:
RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。
在利用RNAi技术对HIV-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现,选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。
同时将抑制序列选择在特定的位点,可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。
此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达,从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。
3 RNAi在整形外科领域的应用前景
已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因,其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。
而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。
使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达,不仅抑制了肿瘤细胞生长,而且减弱了其侵袭能力,为黑素瘤基因治疗奠定了基础。
最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素,其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。
使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。
此外,剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。
瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病,目前尚无有确切疗效的治疗方法。
使用特异
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