医疗器械微生物试验操作规程.docx
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医疗器械微生物试验操作规程.docx
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医疗器械微生物试验操作规程
前言
为满足本公司产品的生物性能检测特制定本规程。
本检验规程是依据GB14233.2、GB15980、2015版《中国药典》等标准汇编而成,同时引用本公司相关操作规程。
本规程适用于本公司所有产品的微生物性能检测。
本规程由天台县康生医疗器械有限公司质管科编制。
本规程主要起草人:
陈春雪
本规程审核人:
干涛涛
本规程批准人:
周婷
本规程实施日期:
2016年2月14日
1.微生物实验室注意事项··········································KS/CZ8.2.4-01-01
2.菌落形态、培养方法、存储方法····································KS/CZ8.2.4-01-02
3.菌种传代、接种、销毁············································KS/CZ8.2.4-01-03
4.培养基的制备、灭菌及储存········································KS/CZ8.2.4-01-04
5.产品无菌检查····················································KS/CZ8.2.4-01-05
6.指示灭菌效果检查················································KS/CZ8.2.4-01-06
7.产品初始污染菌检查··············································KS/CZ8.2.4-01-07
8.物体表面菌检查··················································KS/CZ8.2.4-01-08
9.人员手细菌检查··················································KS/CZ8.2.4-01-09
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-01
标题
微生物试验室注意事项
版本
00/00
页次
共2页,第1页
1.目的
明确微生物试验室注意事项,确保微生物试验室不受人员、物品的交叉污染。
2.范围
本规程适用于本公司微生物试验室人员及物品相关活动。
3.依据
《中国药典》2015年版二部附录XIQ“药品微生物实验室规范指导原则”
4.职责
质管科长、化验员应对本规程负责。
4、注意事项
4.1环境条件
本公司微生物实验室共3个工作区域,分别为微生物限度室、无菌检验室、阳性菌对照室,洁净级别为10000级,并具备100级的超净工作台。
可满足供试品在万级环境中局部百级净化条件下进行试验,对此环境应定期清洁、消毒。
4.2环境、人员、器具控制
a、定期检查无菌环境的空气是否符合规定;
b、定期检测无菌环境物体表面菌是否符合规定;
c、无菌室在使用前开启紫外线灯30min进行空气消毒;
d、除工作人员外,未经允许不得进入微生物试验室,进入微生物试验室的人员应按照《微生物试验室人员净化操作规程》进行净化,方可进入。
e、进入微生物试验室的的一切物品应进行消毒、灭菌或除热源方可进入;未经灭菌和除热源的物品,应用75%酒精进行表面消毒。
f、实验操作前人员手部应用75%酒精进行表面消毒。
g、在做接种、无菌培养基倾注时均需在相应的工作环境下的超净工作台内进行。
4.3检验过程的控制
a、在所有操作中均不应大幅度或快速动作,以免搅动空气中尘埃微粒。
b、使用玻璃器皿应轻取轻放,避免破损,以防培养物扩散。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-01
标题
微生物试验室注意事项
版本
00/00
页次
共2页,第2页
c、在接种时,接种管应接近火焰区操作。
d、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。
e、用分度吸量管接种供试液时,应用橡胶乳头套在吸管上端,吸吹供试液或培养液等,切勿用嘴直接吸吹吸管。
f、当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上,一般不宜再用,应另换无菌塞,或通过火焰处理后再用。
g、每个洁净工作区域的工作人员最多不超过2人。
4.4意外事故的控制
a、假定无菌衣受污染,应脱下翻转包裹,使污染部分包在内部,送往消毒,经灭菌后,洗涤再用,并对该区域环境进行清洁、消毒。
b、因偶然打破盛有培养物的器皿,致使病原性的菌毒种外溢,污染了工作室及操作者的衣物及体表时,当事人应冷静,切勿乱动以免扩大污染面。
应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上,或将消毒液倒在污染区,浸没一定时间。
先从外至内逐步清理污染源,最后将衣物彻底灭菌。
清理时应避免用手指收集玻璃碎片,以防污染皮肤,造成病原性微生物感染事故。
c、对一般小面积的污染可自行处理,较大范围的污染则请人协助。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-02
标题
菌落形态、培养方法、存储方法
版本
00/00
页次
共3页,第1页
1.目的
了解菌落形态、选择适宜的培养基进行培养观察以及合理的培养基存储方法,确保试验结果不因方法而导致失败。
2.适用范围
适用于本公司的所有微生物实验中的菌落培养观察及培养基存储。
3.引用依据
GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:
生物试验方法》
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIH“无菌检查法”
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIQ“药品微生物实验室规范指导原则”
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”
4.职责
化验员有责任对本操作规程对产品所需的生物学性能进行检验、验证、判定,并对结果负责。
5.菌落种类
常见菌落有以下几种,详细见下图。
细菌形态图1-1
真菌—霉菌菌形态图1-2
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-02
标题
菌落形态、培养方法、存储方法
版本
00/00
页次
共3页,第2页
真菌—酵母菌形态图1-2
6.培养条件
菌落名称
用途
培养基名称
培养温度
培养时间
细菌
产品无菌检查
硫乙醇酸盐流体
30℃~35℃
14d
细菌
微生物限度检查
营养琼脂
30℃~35℃
72h
沉降菌
环境监测
营养琼脂
30℃~35℃
48h
浮游菌
环境监测、工艺用气
营养琼脂
30℃~35℃
48h
真菌
产品无菌检查
改良马丁
23℃~28℃
14d
霉菌
微生物限度检查
玫瑰红钠琼脂
23℃~28℃
120h
酵母菌
微生物限度检查
玫瑰红钠琼脂
23℃~28℃
120h
ATCC9372
指示菌灭菌效果检查
营养肉汤
37℃
7d
培养基接种
金黄色葡萄球菌
培养基的灵敏度检查
营养肉汤、营养琼脂
30℃~35℃
72h
枯草芽孢杆菌
培养基的灵敏度检查
营养肉汤、营养琼脂
30℃~35℃
72h
铜绿假单胞菌
培养基的灵敏度检查
营养肉汤、营养琼脂
30℃~35℃
72h
生孢梭菌
培养基的灵敏度检查
硫乙醇酸盐流体
30℃~35℃
72h
白色念珠菌
培养基的灵敏度检查
改良马丁
23℃~28℃
5天
黑曲霉
培养基的灵敏度检查
改良马丁
23℃~28℃
5天
适用性检查
金黄色葡萄球菌
微生物限度细菌、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
营养琼脂培养基
30℃~35℃
48h
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-02
标题
菌落形态、培养方法、存储方法
版本
00/00
页次
共3页,第3页
菌落名称
用途
培养基名称
培养温度
培养时间
大肠埃希菌
微生物限度细菌、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
营养琼脂培养基
30℃~35℃
48h
枯草芽孢杆菌
微生物限度细菌、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
营养琼脂培养基
30℃~35℃
48h
白色念珠菌
微生物限度细菌、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
玫瑰红钠培养基
23℃~28℃
72h
黑曲霉
微生物限度细菌、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查
玫瑰红钠培养基
23℃~28℃
72h
7.菌种保存条件
采用琼脂斜面低温保藏法,在2℃~8℃情况下,保存验证过的存储期内使用。
菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用,若保存在在2℃~8℃,可在24h内使用(若有黑曲霉孢子悬液可保存在2℃~8℃,在验证过的存储期内使用)。
指示菌按使用说明书的储存方法进行保存。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-03
标题
菌种传代、接种、销毁
版本
00/00
页次
共2页,第1页
1.目的
明确菌种的传代、接种、销毁的操作方法,确保人员、环境安全。
2.适用范围
本规程仅适用于本公司微生物试验室的菌种传代、接种及销毁。
3.依据
《中国药典》2015版
3.责任
质管科长、微生物检验员对本规程的实施负责。
4.内容:
4.1来源:
检定菌种由检验部门提供已接种好的菌种斜面。
4.2保存
4.2.1将购来的试管斜面菌种放入冰箱中冷藏保存。
4.2.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中保存。
4.2.3每只保存菌种需标明菌名、统一编号、接种日期。
4.3传代和接种
4.3.1试验用菌种每月传代一次,在对照室内的净化工作台内进行传代和接种。
4.3.2先点燃酒精灯,在火焰旁的上部空间操作。
烧灼接种环。
4.3.3再将原有的菌种斜面培养基(简称菌种管)与待种的新鲜斜面培养基(简称接种管),持在左手拇指、食指及中指之间,要注意能清楚地观察到斜面,菌种管在前,接种管在后。
应斜持试管呈45º角,使试管内斜面向上,两试管口平齐,注意不要持成水平,以免管底凝集水浸湿培养基表面。
4.3.4首先,以右手在火焰旁转动两管的棉塞,以便接种时易于拨取。
再以右手持接种环的柄端,垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。
顶端地环必须烧红,以彻底灭菌。
环以上凡接种时可进入试管的部分,应通过火焰烧灼。
烧灼时,应把环置于酒精灯的外焰上,因外焰的温度比内焰高,容易烧红。
4.3.5使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间,在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞,持住。
再将试管口在火焰上通过,以杀灭关口可能沾污的细菌,但勿烧烫。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-03
标题
菌种传代、接种、销毁
版本
00/00
页次
共2页,第2页
4.3.6先将烧灼过的接种环插入菌种管内,先接触无菌苔生长的培养基上,如有熔印则表明接种环未冷却,能烫死细菌。
一定待冷后,再从斜面上挑取菌苔少许。
取出时接种环不能通过火焰,应
在火焰旁迅速插入接种管,在斜面上轻轻划线接种。
划线时一般先由下而上划一直线后,再由下而上划曲线。
操作过程应迅速,勿使菌苔沾至管壁或管口。
4.3.7当接种完毕,立即将管口通过火焰灭菌,右手到火焰旁塞上棉塞,不要将管口离开火焰
旁去接右手的棉塞。
最后将接种环烧灼灭菌放置原处,再把可能未塞紧的棉塞塞紧,即可进行培养。
4.3.8操作过程中,如因不慎使棉塞触及火焰而着火,切勿用口吹,须在刚刚着火时迅速塞入试管,因管内氧气不足会很快熄灭。
若棉塞外端着火,可用手捏熄。
若棉塞烧杯不宜再用,可另取未接种斜面培养基上的灭菌棉塞,代替塞上。
5.销毁方法
菌种进行销毁时,先将培养管置高压蒸汽灭菌器内,在121℃下灭菌30分钟,冷却后将接种管内装入一定量的75%的酒精溶液,浸泡8小时,在进行处理和清洗。
6.文件
6.1菌种申购登记
当在指定药监部门申购菌种成功后,应对购买的菌种进行分类编写台帐,收到菌种后应立即进行编号,详细记录菌种来源、学名、用途、批号、传代、冻干日期、和数量。
6.2菌种传代等级
当进行菌种传代接种时应进行等级,对传代的菌种名称、批号、代次等进行记录,以便追溯。
6.3菌种销毁处理
本公司生物指示菌或对照菌,根据药典分类属于第4类病原微生物,是指在通常情况下不会引起人类或动物疾病的微生物。
根据《中国药典》2015版销毁指导原则,需经本公司部门负责人批准,方可销毁。
销毁应进行记录,记录内容应记录销毁原因、销毁方式、销毁日期、菌种名称、批号、代次等。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-04
标题
培养基的制备、灭菌及储存
版本
00/00
页次
共2页,第1页
1.目的
明确培养基的配制原理,选择适宜的灭菌及存储方法,确保培养满足微生物试验要求。
2.适用范围
适用于本公司与微生物试验相关的培养基的制备、灭菌及存储。
3.引用依据
GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:
生物试验方法》
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIH“无菌检查法”
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIQ“药品微生物实验室规范指导原则”
《中华人民共和国药典》2015年版二部附录XIJ“微生物限度检查法”
4.职责
化验员有责任按照本操作规程对所需培养基的制备、灭菌及储存工作负责。
5.培养基
根据试产品检测对培养基用途进行分类,见表1。
表1培养基
培养基名称
用途
硫乙醇酸盐流体培养基
产品无菌检查,用于好氧菌、厌氧菌培养
改良马丁培养基
产品无菌检查,用于真菌培养
营养琼脂培养基
微生物限度细菌、沉降菌、浮游菌、工艺用气菌落计算
营养肉汤培养基
指示菌灭菌效果观察
玫瑰红钠琼脂培养基
微生物限度霉菌和酵母菌计算
6.制备、灭菌及储存方法
6.1设备及器具的处理
设备、器具名称:
高压灭菌锅、电炉、烧杯、量筒、玻璃棒、试管等。
设备、器具处理:
将与供试液接触的所有器具应进行可靠的方法灭菌,置压力蒸汽灭菌锅内在121℃时灭菌30分钟。
6.1硫乙醇酸盐流体培养基:
取本品29.25g加入1L纯化水,微温溶解,调节pH值为弱碱性,煮
沸,在121℃灭菌15分钟后,调节pH值为7.1±0.2,分装适宜的容器内灭菌后备用。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-04
标题
培养基的制备、灭菌及储存
版本
00/00
页次
共2页,第2页
6.2改良马丁培养基:
取本品28.5g加入1L纯化水,微温溶解,调节pH值为6.8,煮沸,在121℃灭菌15分钟后,调节pH值为6.4±0.2,分装适宜的容器内灭菌后备用。
6.3营养琼脂培养基:
取本品32g加入1L纯化水,微温溶解,调节pH值为弱碱性,煮沸,在121℃灭菌15分钟后,调节pH值为7.2±0.2,分装适宜的容器内灭菌后备用。
6.4营养肉汤培养基:
取本品18g加入1L纯化水,微温溶解,调节pH值为弱碱性,煮沸,在121℃灭菌15分钟后,调节pH值为7.2±0.2,分装适宜的容器内灭菌后备用。
6.5玫瑰红钠琼脂培养基:
取本品31g加入1L纯化水,微温溶解,煮沸,分装适宜的容器内,在121℃灭菌15分钟后备用。
注:
不同规格的培养基根据使用说明进行稀释配置。
7.储存方法
各培养基储存方法见表2
培养基的储存方法表2
培养基名称
储存条件
温度
环境
非密闭容器保存期限
密闭容器保存期限
硫乙醇酸盐流体培养基
2~25℃
避光
3周内使用
1年内使用
改良马丁培养基
2~25℃
避光
3周内使用
1年内使用
营养琼脂培养基
2~25℃
避光
3周内使用
1年内使用
营养肉汤培养基
2~25℃
避光
3周内使用
1年内使用
玫瑰红钠琼脂培养基
2~25℃
避光
3周内使用
1年内使用
8.文件
应对配制的培养基进行记录,记录内容至少包括用量、配置数量、用途、配置日期、灭菌日期等。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-05
标题
产品无菌检查
版本
00/00
页次
共5页,第1页
1.目的
明确产品无菌试验方法,确保试验结果准确无误。
2.适用范围
适用于本公司产品的无菌试验及相关的验证。
3.原理
本试验系将产品直接接种于培养基内,以检验供试品是否有细菌和真菌污染。
3.引用依据
GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:
生物试验方法》
《中国药典》2015年版二部附录XIH“无菌检查法”
《中国药典》2015年版二部附录XIQ“药品微生物实验室规范指导原则”
4.职责
化验员有责任按照本操作规程对产品所需的生物学性能进行检验、验证、判定,并对结果负责。
5.器具及试剂
5.1器材
a)试管
b)酒精灯
c)75%乙醇棉
d)灭菌刻度吸管(1ml)
e)灭菌平皿(9cm)
f)锥形瓶
g)三角烧瓶
h)灭菌剪刀、镊子
i)恒温培养箱
j)生化培养箱
k)高压蒸汽灭菌器
l)恒温烤箱
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-05
标题
产品无菌检查
版本
00/00
页次
共5页,第2页
5.2培养基
a)流体硫乙醇酸盐培养基
b)改良马丁培养基
c)营养琼脂培养基
5.3稀释液或洗脱液
0.9%无菌氯化钠。
5.4对照菌
金黄色葡萄球菌。
6.试验前准备
6.1培养基的制备:
按《培养基的制备、灭菌及储存》方法进行。
6.2器具的灭菌:
与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸气灭菌器内121℃30min,或置电热干燥箱内160℃2h。
6.3供试品的制备:
采用将供试品拆散或剪成小碎段直接投入到足以浸没供试品的适量的培养基内培养。
供试品制备方法表1
供试品名称
供试品制备方法
一次性使用胸腔引流装置水封式
剪下导管约1厘米
集尿袋
剪下导管约1厘米
口垫
完整产品
7试验方法(直接接种方法):
7.1供试品接种培养基方法:
各供试品应在无菌条件下接种,取上述制备的供试品,在近火焰上以右手握拳,小指为主拔开培养基管的塞子,管口通过火焰,移至火焰下侧,沿着培养基管壁投入供试品(供试品体积不得大于培养基体积的10%),轻轻摇匀。
具体培养基装量见表2。
文件名称
实验室操作维护及保养规程
文件编号
KS/CZ8.2.4-01-05
标题
产品无菌检查
版本
00/00
页次
共5页,第3页
培养基装量表2
供试品名称
培养基装量
硫乙醇酸盐
改良马丁
一次性使用胸腔引流装置水封式
15mL
15mL
集尿袋
15mL
15mL
口垫
15mL
15mL
7.2供试品接种每种培养基所需的最少检验数量:
接种每种培养基所需的最少检验数量按中国药典2015版附录ⅪH《无菌检查法》中供试品的无菌检查中“表1批出厂产品最少检验数量”来取样。
培养基接种管数量见表3。
培养基接种管数量表3
供试品
批产量N(个)
接种每种培养基所需的最少检验数量
一次性使用胸腔引流装置水封式
≤100
10%或4件(取较多者)
100 10件 >500 2%或20件(取较少者) 集尿袋 ≤100 10%或4件(取较多者) 100 10件 >500 2%或20件(取较少者) 口垫 ≤100 10%或4件(取较多者) 100 10件 >500 2%或20件(取较少者) 7.3阳性对照接种 取硫乙醇酸盐流体培养基1管,然后再接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌1mL,同7.1方法操作,作为阳性对照。 7.4阴性对照接种 取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各1管,用0.9%无菌氯化钠溶液各接种1mL,同7.1方法操作,作为阴性对照。 7.5操作环境检测 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。 无菌室在消毒处理 文件名称 实验室操作维护及保养规程 文件编号 KS/CZ8.2.4-01-05 标题 产品无菌检查 版本 00/00 页次 共5页,第4页 完毕后,应检查空气中的菌落数,方法如下: 取直径约90mm培养皿,无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL,在30℃~35℃培养48h证明无菌后,取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖,暴露30min后盖好。 8.培养方法 各培养管培养方法见表4 培养方法表4 菌落名称 培养基名称 培养温度 培养时间 细菌 硫乙醇酸盐流体培养基 30℃~35℃ 14d 真菌 改良马丁培养基 23℃~28℃ 14d 阳性对照 硫乙醇酸盐流体培养基 30℃~35℃ 48~72h 阴性对照 硫乙醇酸盐流体培养基 30℃~35℃ 14d 改良马丁培养基 23℃~28℃ 14d 环境检测 营养琼脂培养基 30℃~35℃ 48h 9.培养及观察 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。 如在加入供试品后、或在培养过程中培养基出现浑浊,培养14天后,不能从外观上判断有无微生物生长,可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中,细菌培养2天,真菌培养3天,观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊;或取培养液涂片,染色,镜检,判断是否有菌。 阳性对照管菌落应生长良好,阴性对照管,不得有菌生长,否则试验无效。 环境检测3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个。 10.结果判断: 阳性对照管应生长良好,阴性对照管不得有菌生长。 否则,试验无效。 若供试品管均澄清,或虽显浑浊但经确证无菌生长,判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长,判供试品不符合规定,除非能充分证明试验结果无效,即生长的微生物非供试品所含。 当符合下列至少一个条件时,方可判试验结果无效: (1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求; (2)回顾无菌试验过程,发现有可能引起微生物污染的因素; 文件名称 实验室操作维护及保养规程 文件编号 KS/CZ8.2.4-01-05 标题 产品无菌检查 版本 00/00 页次 共5页,第5页 (3)供试品管中生长的微生物经鉴定后,确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。 试验若经确认无效,应重试。 重试时,重新取同量供试
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