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电化学分析文献翻译
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用于检测真菌毒素的亲和型电化学传感器
本文综述了电化学生物传感器对食品中真菌毒素的测定现状。
真菌毒素是有毒霉菌产生的高毒性次生代谢。
这些急性毒性物质严重的导致了人类和动物的健康问题,但直到20世纪60年代以来第一个研究者才发现曲霉毒素有致癌性。
真菌毒素广泛的影响农业产品,最重要的是谷物及与谷物为基础的食品。
大多数国家,特别是欧盟,为了控制和预防真菌毒素对食品的污染已经制定了严格的法律计划。
霉菌毒素的官方分析方法通常需要精密仪器仪表,如液相色谱,荧光或质量检测器,结合提取程序进行样品制备。
约十六年,基于亲和性传感器所产生的更简单和更快速的分析程序已经出现在科学文献中,这些科学文献被认为是一个非常有前途的替代方案,特别是电化学(即安培,阻抗,电势和电导率)的亲和性的生物传感器,由于其简单性和灵敏度。
通常,尽管重组抗体,人工受体和分子印迹聚合物显示出潜在效用。
但是电化学生物传感器还是把对于真菌毒素使用特定的抗体或适体作为亲和配体。
本文主要是综述了用于真菌毒素的亲和性生物传感器的研究进展,涉及了大约从十六年前的第一次报告以来的所有文献。
1.简介
霉菌毒素是一个庞大而多样的组模的次生代谢产物,他们都具有共同的特点,都是由真菌产生的,对脊椎动物和其他生物具有毒性作用。
丝状真菌产生成千上万的有毒化合物.但最重要的霉菌毒素属于曲霉属,镰刀菌属,和青霉属物种(莫斯,1996)。
从毒理学和立法的角度来看最相关的真菌毒素是黄曲霉毒素,赭曲霉毒素,某些单端孢霉烯(伏马毒素,脱氧,T-2,HT-2,和玉米赤霉烯酮),棒曲霉素,桔霉素,和麦角生物碱。
1.所选的分子的化学结构示于图1(BennettandKlich,2003)。
真菌毒素影响广泛的农产品包括谷物、谷类食物、干果、葡萄酒、牛奶、咖啡咖啡豆、可可面包店或肉类产品,这是许多发展中国家的经济的基础(Shephardetal.,2012)
真菌毒素可能只要作物生长就存在了,但直到最近其真正的化学性质仍然不是很清楚。
在20世纪60年代早期人们开始考虑去发现黄曲霉素、并且识别和测定它是根据发生和/或该疾病(霉菌毒素中毒症)产生的严重程度,特别是如果它们被认为是致癌物质。
用官方的方法测定真菌毒素通常在认可的具有先进的仪器与荧光高效液相色谱法(HPLC)(粤)或质量(MS)探测器的实验室,但现场对于小型设备和快速测定的需求也不断增加。
在大约过去16年来,发展新亲和力生物传感器的霉菌毒素的许多新方法已经出现了特别是电化学生物传感器,这是本次审查的主要议题。
一些优秀的评论是可用的分析方法,为确定真菌毒素生物传感器,电化学生物传感器。
这次审查目标覆盖了电化学生物传感器霉菌毒素的全部范围。
特别感兴趣的是食品污染和共轭(掩盖)霉菌毒素的存在衍生品。
分析测定食品中真菌毒素是极其重要的,由于其高毒性在人类和动物,和世界各地的许多国家已经建立了非常严格的控制,这些食物可能会在收获或储存期间受到污染。
随着全球化和世界贸易,霉菌毒素问题在未来几年将显著增长。
2.真菌毒素的重要性
2.1毒性
食品的霉菌毒素的污染已成为一个极大的关注的问题,因为这些都是导致许多疾病的原因。
(Richard,2007).据估计,全世界25%的粮食受产毒真菌的影响,结果真菌毒素已经成为食物链的一部分。
饮食中高水平的霉菌毒素对人体健康和各种各样的动物造成了不良的急性和慢性影响。
副作用尤其可能影响肝脏,肾脏,神经系统,内分泌和免疫系统。
在20世纪60年代初黄曲霉毒素B1(AFB1)(黄曲霉素和寄生曲霉)首次被提出,它是一种强有力的人类的致癌物(据IARC分类的第一类危险的致癌物质)并且也是引起动物肝脏肿瘤的主要原因。
黄曲霉毒素出现在每克不同种类的食物产品中的低子纳克范围内,由于致癌性立刻产生了符合食品安全的立法规定和新的要求。
(Olsenetal.,2006)。
当AFB1以饲料的形式被奶牛摄取,它就被转化成其羟基化的代谢产物,之后黄曲霉毒素M1(AFM1)被分泌在牛奶中。
不幸的是,AFM1在牛奶巴氏杀菌和存储过程中以及各种奶制品的制备过程中是相对稳定的。
(Gordon,2009).
赭曲霉毒素,特别是赭曲霉毒素A(OTA)(曲霉菌和青霉真菌)的首次分离于1965年,它发现于各种各样的商品中,主要集中在谷物中。
由于存在于食物链中OTA的持续性和携带效应,OTA还可以从被喂食受污染饲料的动物中污染牛奶或禽肉。
OTA属于第二危险等级的致癌性物质,并且是已知的诱变,致畸和免疫。
其他代谢产物如赭曲霉毒素B和C很少出现在食品中的。
赤霉菌产生伏马菌素和单端孢(脱氧雪腐镰刀菌烯醇,T-2,HT-2,玉米赤霉烯酮),化学结构如图1所示。
伏马菌素在20世纪80年代中期被发现,它是长链聚羟基烷基胺含有三片段。
至少有13个结构不同的伏马菌素已被描述。
影响人类重要身体健康的最主要是是伏马菌素B1和B2(分别为FB1和FB2)包括肝肾肿瘤和食道癌。
(Scott,2012)单端孢型A(脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇型,分别命名为DON和NIV)是循环倍半萜,同时引起由肾脏问题导致的厌食和呕吐。
玉米赤霉烯酮(ZEA,是一种
玉米赤霉醇)它们的代谢物是具有雌激素作用和生殖毒性的雌激素的类似物。
镰刀菌毒素的毒性效应对动物产生严重的作用,例如猪,禽,牛,马。
另一个重点领域是由于霉菌毒素廉价的,易于得到的,它可以应用到小队敌人中去,所以在战争中利用一些单端孢-B型(T-2,HT-2)真菌毒素作为生物武器。
(RaiandVarma,2010)
2.2.欧洲立法
从2000年代中期,大约100个国家(覆盖世界人口约85%)有具体的规定或真菌毒素在食品中出现的详细准则(Van-Egmondetal.,2007)。
全面客观的保护消费者的健康,对减少食品中大量商品的出场作了共同的支持与描述。
2007).在欧盟(EU)国家自20世纪60年代以来根据国家法规增加基于权威机构的科学意见,例如EFSA(欧洲食品安全局)FVO(食品和兽医办公室)和CPVO(植物品种共同体局),给哪些要求进行足够的采样,警报和分析方法的人建议(Olsenetal.,2006;Van-Egmondetal.,2007)。
在欧盟统一规定,现在对于一些真菌毒素,食品组合存在。
其中最重要的立法是国会法规2006/1181(委员会建议,2006年)制定黄曲霉毒素的最高水平,赭曲霉素,棒曲霉素,DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇),ZEA玉米赤霉烯酮,伏马菌素和无限的T-2和HT-2。
而HT-2和T-2的高毒性被支承,缺乏足够灵敏的分析方法,使它们的最大浓度水平都在等待欧盟定义。
国会法规1126/2007更新镰刀霉菌毒素的玉米和玉米产品(DON,ZEA伏马毒素)的最大允许水平的范围为每千克玉米含50-2000微克(委员会的建议,2007年)。
允许的范围取决于毒性,但欧盟立法也规定在食品中直接用于人类消费的那种食物为每公斤两微克(委员会建议,2006年)。
例如AFM1,虽然没有有效的作为AFB1,食用牛奶内的含量为每千克0.05微克,由于婴儿和儿童对牛奶的高消费水平。
赭曲霉素允许的浓度也很小,约在每公斤0.5〜10微克的范围内,也根据食物的种类决定(委员会的建议,2006年)。
分析霉菌毒素的官方控制(委员会指令,2005年)Samplig方法,预防/还原建议(委员会推荐要求-议书,2006年)和用于动物饲养的产品要有法规限制(委员会建议,2006年b)也可以来自欧洲联盟。
2.3霉菌毒素的测定分析技术
由于低浓度ppb通常被涉及到,所以非常敏感的霉菌毒素的分析方法是必要的。
(KrskaandMolinelli,2007).常规分析方法主要是基于分离工具技术(如高效液色谱法,高效液相色谱法)和筛选酶免疫测定用途(如酶联免疫分析,酶联免疫吸附)(Koppenetal.,2010).
目前在正式方法中使用的分析技术是反相柱高效液相色谱法,利用分子荧光(Shephard,2009),紫外吸收或质谱检测器(Turneretal.,2009),得到的0.01-5纳克毫升-1的检测限。
这些方法包括富集和清理程序用于去除样品中的矩阵和干扰,例如用于包含抗霉菌毒素的免疫亲和柱和固相萃取柱的有机溶剂。
有时分析物衍生对于光学检测是必要的。
一些霉菌毒素的内在电活性已利用来开发安培检测中如HPLC玉米赤霉烯酮(SmythandFrischkorn,1980;Campasetal.,2012),DON的吸附溶出伏安法,黄曲霉毒素B1和B2的痕量水平(Campasetal.,2012),葡萄酒中OTA的方伏安法(Perrottaetal.,2011)ZEA的安培的筛选和代谢物的α,β-玉米赤霉烯醇(Zougaghetal.,2008),和一个96孔ELIME阵列的DON直接电化学传感和微波水解后的瓜萎镰菌醇的样品(Riccietal.,2009),但这些方法都不满足食品应用所需的灵敏度(Prieto-Simonetal.,2007).
ELISA微孔板分光光度法已成为20年来快速检测霉菌毒素最有用的工具之一,尤其是对原材料的筛选,有时得到了低至0.1毫微克−1的检测限。
(Zhengetal.2006)该技术是基于特异性抗体的能力去区分真菌毒素的三维结构和在大约1到2小时的时间内尽力一个有竞争力的繁殖。
尽管高基体的依赖,并有可能高估,ELISA试剂盒的巨大优势是速度快,易于操作,灵敏度和高样品通量。
许多霉菌毒素的商业ELISA试剂盒被建立,以及可供现场使用。
(CigicandProsen,2009).其他一些免疫分析技术已被开发,其中的一个最简单的和最快的(在几分钟内响应)技术是侧流装置,通常是在一个条带或浸渍片的格式但只是定性或测试的截止值的信息能被检测。
(Maragos,2004).例如,在这样一个棒的底座上如果存在于样品提取液中的黄曲霉毒素和胶体金标记抗黄曲霉毒素抗体相互作用。
(KrskaandMolinelli,2007)
由于食品安全的控制和对于检测真菌毒素快速和准确的方法高要求,发展生物传感器是至关重要的,在过去的20年里生物传感器的发展显著加快,目前它是霉菌毒素分析研究中最活跃的领域之一。
(Riccietal.,2007)生物传感器涉及与传感器接触的识别元件(如酶,抗体,核酸或人工受体)。
相关的霉菌毒素的物理化学性质(如荧光)或转导型,四组生物传感器主要用于:
发光/比色(Goryachevaetal.,2007),表面等离子体共振(SPR)传感器(Maragos,2004),质量敏感的石英—晶体微天平(QCM)传感器(Vidaletal.,2009),和
电化学传感器(Laschietal.,2011).生物传感器的重要性主要取决于其高灵敏度和最小的样品处理的特异性。
其他的一些综述总结电化学
(Tombellietal.,2009;PalchettiandMascini,2012),optical(Goryachevaetal.,2007;Zhengetal.,2006)和其他(Maragos,2004;Goryachevaetal.,2007;Prieto-Simonetal.,2007)用于毒素分析的生物传感器。
电化学传感器在以上的群体中占据主导地位,它是本文综述的主题。
3.电化学生物传感器的亲和力霉菌毒素
电化学生物传感器用于检测真菌毒素是由于它们的灵敏度,选择性好,低成本,简单突出,并且在某些情况下的小型化,便携和集成在自动化装置(Farreetal.,2009)。
他们中的大多数是基于抗原和特异性抗体,但新颖特异性配体(例如核酸适体)之间的高亲和力相互作用不断涌现。
(PalchettiandMascini,2008;Laschietal.,2011;Grieshaberetal.,2008,)已经用各种电化学技术(安培,电位,电导,阻抗)改造毒素的相互作用来分析信号。
3.1电化学传导
安培(伏安法)无疑是最合适的电化学传感器由于其高灵敏度和响应工作在多种霉菌毒素的含量。
广泛使用的电流分析法是基于测量的电流在一个固定的(恒电势的控制)或变量(伏安法)的潜力。
大量的研究工作已经指向发现电极结构或纳米结构。
极通常用惰性金属(Pt,Au)或碳(石墨,玻璃碳),虽然主要的缺点是测量之间的再生,所以今天一次性使用的丝网印刷电极(SPES),性格化的低成本和大规模生产,广泛用于克服这个问题。
电化学阻抗谱(EIS)是一个功能强大的,非常敏感的,非破坏性的和信息技术,它允许以研究所述感测装置接口的电特性和跟踪在其上发生的反应(Laschietal,2011;Zamfiretal.,2011)。
无标记的电化学阻抗谱免疫跟随在来自真菌毒素的络合产生的范围内为每毫升1-20纳克的工作电极表面的变化的电子传导阻力,用约每毫升0.5纳克的检测限。
电化学阻抗谱生物传感器的主要优点之一就是不需要接合抗体与酶或真菌毒素,提供电化学信号(Grieshaberetal.,2008)这意味着修改电极表面,例如使用一个金电极表面4-羧基苯基(4-CP)膜接枝的电化学还原相应的4-羧基苯基的抗体构建一个敏感的阻抗免疫传感器检测OTA的共价键的重氮盐。
虽然不太使用由于低信号/噪声比,电位(Rameiletal.,2010)和交流电导率(Liuetal.,2006)免疫传感器也被免疫传感器也被描述为黄曲霉(Rameiletal.,2010;Liuetal.,2006)等人,和DON(Kwonetal.,2011)的毒素。
电位装置探测变化的潜力在零电流,而电导检测设备的变化传导两个电极之间。
化学敏场效应晶体管(chemFET处)是一个重要的该电位生物传感器群,并已用于检测DON(Kwonetal.,2011)。
3.2.识别受体
2012).天然(抗体,DNA)和人工(改造抗体,抗体片段,适体和受体样分子印迹聚合物)已被用于选择性结合毒素分子(Romanazzoetal.,2010;Campasetal;2012)
提出对所选真菌毒素特异性抗体是最常见的(RasoolyandHerold,2007),但适体的使用作为配位体识别目前在生长的OTA的情况下。
有些作者使用的霉菌毒素产生的酶抑制作用获取酶生物传感器用于这些分析。
然而,这种生物传感器的主要问题是缺乏选择性,因为从样品其他毒素或分子也可能抑制酶反应(Arduinietal.,2007)。
例如,安培生物传感器被用于孢霉菌毒素(AOH,AME)定量与碳糊电极蘑菇酪氨酸酶的发展,对黄曲霉毒素B1抑制乙酰胆碱酯酶(Moressietal.,1999)(Pohankaetal.,2010;Arduinietal.,2010;Ben-Rejebetal.,2009;Cucciolonietal.,2008)。
这些传感器仍然作为一个“概念验证”,而不是实际化验,由于缺乏选择性(例如疼痛是不可逆地抑制由有机磷和氨基甲酸酯农药(Vidaletal.,2008)和高LODs。
3.2.1抗体和抗体片段
真菌毒素特异性抗体的合成已经允许依赖于选择性识别真菌毒素的任何表位的一系列的分析的免疫测定。
霉菌毒素是小的,非免疫原性分子(半抗原),并必须要绑定到合适的载体蛋白以引发足够的免疫反应。
这意味着对于蛋白质的某种可能的亲和力,如对于BSA(Vidaletal.,2011).大多数免疫传感器检测真菌毒素是基于竞争性测定法,和典型格式,包括直接和间接的方案(Maragos,2009年),但是由于这些分子的尺寸小并不是三明治格式。
从他们的生产方式,有三种抗体:
多克隆抗体(pAb),单克隆(mAb)和重组(RAB)。
多克隆是从具有低成本和易于开发的免疫动物的血液中纯化的。
小心纯化缀合物(获得选择性)是非常重要的,有时用于该结合物会出现交叉反应的蛋白质(例如,BSA)。
单克隆抗体是是来源于通过融合小鼠骨髓瘤细胞得到的阳性杂交瘤和免疫小鼠的脾脏细胞。
相同分析性能的均匀性和无限的生产是他们的优势。
第三代抗体技术是重组抗体(rAbs),它不需要动物。
一些抗体的功能基因被克隆并从阳性杂交瘤或具有或不具有免疫的脾细胞传送到原核或真核器官(转基因生物)。
最后,重组是可表达,筛选和收集的。
抗体也可以被认为是还原剂或蛋白水解酶产生的碎片,保留了抗原片段处理结合区(FAB)和增加的亲和力和特异性(Maragos,2009).另外也可以用重组技术来隔离免疫球蛋白主要涉及与毒素结合可变部分。
(Maragos,2009).Fab片段作为整个抗体的一个替代物显示,它们的更小的尺寸有助于非特异性的结合最小化,由于通过Fc片段相互作用和降低
异构系统的空间障(Romanazzoetal.,2010).噬菌体展示的方法也可以用于从霉菌毒素亲和性的肽库,和产生对动物有害的有毒的抗原配位体中识别分子,因此,困难随着传统的抗体提高技术而产生。
3.2.2适体
适体的配体是单链核酸(DNA,RNA),可以以高亲和力和特异性结合到广泛的目标,范围从大的蛋白质小分子,如氨基酸或药物短序列(20-90核苷酸)。
他们是通过一个名为SELEX体外选择过程(系统指数富集配体的进化过程),于1990年首次报道(EllingtonandSzostak,1990)。
适体具有一定的物理化学条件,折叠成定义的三维构象,促进特定交互与目标分子具有高亲和力的常量(Hayatetal.,2012)。
虽然抗体已为数年的霉菌毒素的分子识别标准,适体已经出现,由于固有的优势,相对于抗体免疫动物是不需要的,更多的化学和热稳定性,相对于PABS变异较小,或廉价的体外合成。
特别是,常用的适体不容易受到存在溶剂中的变性真菌毒素的提取。
适体的OTA在2008年被选中,以下是字符化荧光偏振和平衡透析(Cruz-AguadoandPenner,2008a;Cruz-AguadoandPenner,2008b)。
已确定的适体具有较高的特异性OTA,并证明是对OTA的小麦籽粒通过亲和层析耦合到分子荧光检测的决心非常有用。
结合亲和力,制止开采通过平衡透析,是在纳摩尔范围内,相当或以下的结合抗体常量OTA。
由于这两部作品的后果,一些电化学OTAs出现从2010年,首创的一人用磁珠(MBS)作为孵化固体支持开发我们的实验室。
基于核酸适体的电化学传感器是非常敏感的,显示检测的范围限制在每毫升0.03–0.8纳克之间 OTA(表3)通常高于安培免疫传感器在应用得到验证。
预计更多的工作在不久的将来,新的计划是可能的利用附着在氧化还原介质的适体的构象变化。
因为新方案是可能利用附连到氧化还原介体的适体的构象变化。
采用电化学阻抗谱(EIS非常敏感(每毫升最高达10-4纳克OTA)标签免费被描述。
2010年,六个独特的适配子序列经过18轮的SELEX显示绑定FB1亲和力高,其中一个(FB1-39)100730纳米的离解常数。
这项工作打开了新的适配体传感器和固体萃取柱,但迄今为止,没有任何报道。
作为一个初始工作,我们实验室已经证明使用FB1-39的可能性在未来的电化学适体传感器中。
该公司是Neoventures生物技术公司。
拥有专利的具体适体AB1和玉米赤霉烯酮的目标且Kd=10nM,并介绍了OTA,黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮与横向流技术的商业适体为基础的设备
。
在这种情况下,我们发现对于真菌毒素问题新的适体性。
到目前为止,只有特定的适配体的OTA,FB1,AB1和玉米已被报道,但预计在不久的将来,一个大的增加。
3.2.3.DNA和人工受体
黄曲霉毒素的亲和力原生和变性DNA(ss-DNA和ds-DNA)已经证明(Mascinietal.,2001)。
检测杂交反应之间的固定探针和目标在溶液中通过鸟嘌呤的氧化改性AFB1侵入困在双链,它允许测定AFB1范围每升10-30毫克。
在电流允许的条件下,DNA杂交时间造成的黄曲霉毒素M1是我变化范围在1.9-20.9纳米内判定。
一个阻抗滴定的 AFM1生物传感器的基础上的SS的DNA探针和黄金纳米粒子提供了线性响应浓度范围每毫升1–14纳克和应用于牛奶样品。
电化学DNA生物传感器在玻碳电极上的电化学氧化OTA也用于评估OTA和DNA之间的可能的相互作用(奥利维拉等人。
,2007)。
然而,大多数这些杂交的DNA生物传感器有一个巨大的缺乏对环境毒理学应用的选择性和灵敏度,和很少的报道导致了今天这种结果。
超分子有机结构的环糊精和氯茶碱长效是众所周知的强烈绑定的黄曲霉毒素,但没有任何选择性(RaiandVarma,2010)。
相反,分子印迹聚合物(MIP)和结合肽的组合合成得到的,是很好的候选人霉菌毒素亲和配体。
分子印迹聚合物的合成交联官能聚合物的分析物的存在下进行的。
紫外线和热聚合后,分析物或模板分子的去除,从而形成一个腔,其中只有感兴趣的分析物可以安装非常有选择性的靶分子互补,作用类似于合成抗体(Blanco-Lopezetal.,2004)。
然而,尽管一些分析荧光应用(Baggianietal.,2008;Vidaletal.,2012a),MIPS只被施加到OTA选择性清理萃取(JornandEdward,2007)和thricothechene玉米+也(mizaikoff,2003),或在固相柱(Jodlbaueretal.,2002)在非常复杂的食品基质霉菌毒素选择性是主要的问题,而不是作为生物传感应用合成受体
超分子有机结构的环糊精和氯茶碱长效是众所周知的强烈绑定的黄曲霉毒素,但没有任何选择性(RaiandVarma,2010)。
相反,分子印迹聚合物(MIP)和结合肽的组合合成得到的,是很好的候选人霉菌毒素亲和配体。
分子印迹聚合物的合成交联官能聚合物的分析物的存在下进行的Baggianietal.,2008;Vidaletal.,2012a。
紫外线和热聚合后,分析物或模板分子的去除,从而形成一个腔,其中只有感兴趣的分析物可以安装非常有选择性的靶分子互补,作用类似于合成抗体(Blanco-Lopezetal.,2004)。
然而,尽管一些分析荧光应用(Baggianietal.,2008;Vidaletal.,2012a),MIPS只被施加到OTA选择性清理萃取(JornandEdward,2007)和玉米(mizaikoff,2003),或在固相柱(
Jodlbaueretal.,2002)在非常复杂的食品基质霉菌毒素选择性是主要的问题,而不是作为生物传感应用合成受体
4.电化学生物传感器:
选择应用
据报道各种各样的电化学免疫传感器检测限在0.5–20纳克毫升,动态的顺序范围霉菌毒素的浓度高达约为1-100纳克毫升。
(Shephardetal.,2012).最近报道OTA电化学适体传感器与较短孵育时间的常规免疫有相似的或更好的灵敏度和选择性。
安培生物传感器是最常见的,但是EIS使用的越来越频繁。
最近的一些进展(使用MBS,奈米化及其他)的评论在5节。
表1-4总结了记载用于黄曲霉毒素,赭曲霉毒素和其他(trichochetene及其他)的真菌毒素的亲和性电化学生物传感器的完整文献
4.1黄曲霉毒素
黄曲霉毒素特异性抗体的合成已经产生了一系列的竞争性和非竞争性免疫测定技术和大量的ELISA和免疫传感器。
(Lital.,2009)黄曲霉毒素的定量分析在电化学生物传感器测定之前需要样品萃取合适的含水甲醇的溶剂混
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