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生化期末
第十章
一、
中心法则的概念
见右下图示。
二、复制的基本规律
DNA复制的半保留规律要点
✧亲代的DNA分子是双螺旋结构,碱基对之间按照互补原则严格配对A=T、G≡C。
✧复制时,双链解开生成的两条单链,分别作为模板,按照碱基互补原则合成新的单链。
✧新合成的子代DNA分子中,其中一条链来自于亲代DNA,另一条是新合成。
✧两个子代的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。
原核与真核DNA复制的特点
见表10-1。
表10-1 原核与真核复制的特点
原核生物
真核生物
复制起点
一个
多个
复制方向
双向
双向,
电镜图
眼睛状
不清
复制子
单个,又称为复制体
多个
三、DNA复制时的酶学知识(各种酶的功能)
复制的化学反应
✧复制的反应式:
(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi
✧新链的延长方向:
只可沿5’→3’方向进行。
原核生物的DNA聚合酶
原核生物DNA聚合酶的特点见表10-2。
表10-2 原核生物DNA聚合酶的特点
DNA-polI
DNA-polII
DNA-polIII
5’→3’聚合酶活性
+
+
+
5’→3’外切酶活性
+
-
-
3’→5’外切酶活性
+
+
+
基因突变后的致死性
+
-
+
主要功能
复制过程校读、修复、填补缺口
在无polI、III时起聚合作用
延长新核苷酸链的聚合作用
真核生物DNA聚合酶的特点
见表10-3。
表10-3 真核生物DNA聚合酶的特点
DNA-polα
DNA-polβ
DNA-polγ
DNA-polδ
DNA-polε
5’→3’聚合酶活性
+
+
+
+
+
5’→3’外切酶活性
+
+
+
+
+
3’→5’外切酶活性
-
-
+
+
+
主要功能
引物酶活性,起始引发
低保真度的复制
线粒体DNA的复制中
主要催化作用,相当于原核生物聚合酶III,有解螺旋酶活性,延长子链的主要酶
作用是校对、修复和填补空隙,相当于原核生物的聚合酶I
复制的保真性
✧具有3’→5’外切酶活性的酶是复制保真性的基础,原核生物主要是DNA-polI,真核生物主要是DNA-polε。
✧错配出现的频率:
dG/dA>dA/dA>dC/dA
✧复制保真性依赖的三种机制
✓遵守严格的碱基配对规律。
✓聚合酶在复制中对碱基的选择作用。
✓复制错误时有即时的校读功能。
原核生物复制起始的相关蛋白质
见表10-4。
表10-4 原核生物复制起始的相关蛋白质
起始时的相关蛋白质
通用名
蛋白质功能
DnaA
-
辨认起始点
DnaB
解螺旋酶
解开DNA双链
DnaC
-
运送和协同DnaB蛋白
DnaG
引物酶
催化RNA引物的合成
SSB
单链DNA结合蛋白
稳定已解开的单链
拓扑异构酶
-
理顺DNA链
DNA拓扑异构酶的比较
见表10-5。
表10-5 DNA拓扑异构酶的比较
拓扑异构酶I
拓扑异构酶II
曾用名
原核
ω-蛋白
旋转酶
真核
转轴酶、解缠酶、切口封闭酶、松弛酶
分为好几种亚型
功能
切断DNA双链中的一股
切断正超螺旋的DNA分子双链,松弛超螺旋
连接断端,使松弛状恢复负超螺旋状
是否需要ATP
-
-
+
DNA连接酶
记忆要点:
✧连接DNA链3’-OH末端和5’-P末端,生成磷酸二酯键。
✧催化需要消耗ATP。
✧只能连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口。
✧不能连接单独存在的DNA单链或RNA单链。
✧在复制中最后连接缺口,在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用。
✧是基因工程中重要的工具酶。
五种酶催化磷酸二酯键的生成
见表10-6。
表10-6 五种催化磷酸二酯键生成的酶
提供核糖的3’-OH
提供5’-P
反应结果
DNA聚合酶
引物或延长中的新链
游离dNTP去PPi
(dNTP)n+1
RNA聚合酶
单个的NTP或延长中的新链
游离NTP去PPi
(NTP)n+1
逆转录酶
单个的dNTP或延长中的新链
游离dNTP去PPi
(dNTP)n+1
DNA连接酶
复制中不连续的两条单链
不连续→连续
DNA拓扑异构酶
切断整理后的双链
改变拓扑状态
四、DNA生物合成过程,原核与真核生物的比较
原核生物的DNA生物合成
✧复制的起始
✓DNA解成复制叉
DnaA(辨认起始点)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC(协同B蛋白)三种蛋白和SSB参与。
✓引发体的形成
引发体:
解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA起始复制区域的复合结构。
✓引物合成
记忆要点:
1引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
2引物酶就是DnaG蛋白。
3引物合成的方向也是5’→3’方向进行。
✧复制的延长
✓延长的反应式:
(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi。
✓延长的方向:
5’→3’方向进行。
✓领头链是连续合成。
✓随从链是不连续合成,形成多个冈崎片段。
✧冈崎片段
记忆要点
✓定义:
DNA复制中随从链上不连续合成的DNA片段。
✓不连续的复制片段,原核生物大小1000-2000核苷酸,真核生物较短约数百个核苷酸。
✓复制过程可以产生许多冈崎片段。
✓其合成方向也是5‘→3’。
✓每个冈崎片段都带有一个RNA引物。
✧复制的终止
冈崎片段的连接
✓RNA酶水解引物。
✓留下的空缺由DNA-polI来填补。
✓DNA连接酶连接缺口。
真核生物的DNA生物合成
✧复制的起始
记忆要点
✓起始点比E.coli的oriC短。
✓酵母复制起始点含11bp富含AT核心序列:
A(T)TTTATA(G)TTTA(T),称自主复制序列(ARS)。
✓复制的起始需要DNA-polα(引物酶活性)和DNA-polδ(解螺旋酶活性)。
✓复制的起始还需要拓扑酶、复制因子(RF),增殖细胞核抗原(PCNA)。
✧复制的延长
✓引物合成由DNA-polα催化。
✓复制叉及引物生成后,DNA-polδ在PCNA协同下,逐步取代DNA-polα,起主要聚合作用。
✧复制的终止
✓端粒:
真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。
4末端单链DNA序列和蛋白质构成。
5末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。
✓端粒酶:
端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白、端粒酶逆转录酶三部分组成。
提供RNA模板和催化逆转录的功能,是一种特殊的逆转录酶。
五、逆转录与其他复制方式
见表10-7。
表10-7 其它复制方式
染色体外的遗传物质
复制方式
说 明
RNA病毒
逆转录
反应需要逆转录酶
ψX174、M13噬菌体
滚环复制
低等生物的复制形式
线粒体DNA
D-环复制
需要DNA-polγ
六、引起DNA损伤的因素、突变的类型及相应的修复方式
突变的意义
✧突变是进化、分化的分子基础。
。
✧突变可造成只有基因型的突变或致死性的突变。
✧突变是某些疾病的发病基础。
引起DNA损伤的因素
记忆要点:
✧突变因素可以是自发的,也可以是诱发的。
✧诱发的因素包括物理因素和化学因素。
✧物理因素如紫外线照射,使DNA分子形成TT二聚体。
✧化学因素大多数是可致癌的诱变剂:
烷化剂使G碱基N-7位甲基化及其核苷酸缺失。
突变的类型
见表10-8。
表10-8 突变的类型
突变类型
定义
是否造成框移突变
错配
DNA分子上的碱基错配又称为点突变
-
碱基缺失
DNA分子某部碱基的脱落
+
碱基插入
DNA分子某部额外碱基的插入
+
重排或重组
DNA分子内较大片段的交换
- 或 +
DNA损伤的修复
见表10-9。
表10-9 DNA损伤的修复
修复类型
修复目的
修复方式
所需蛋白质因子及功能
光修复
分解TT二聚体
光修复酶催化
光修复酶
切除修复
原核
去除操作的DNA,填补空隙和连接
先切除再填补
①UvrA、UvrB辨认及结合DNA受损部位
②UvrC进行切除
真核
短片段:
DNA糖苷酶水解→核酸内切酶→DNA-polε
长片段(十个核苷酸):
核酸内切酶→DNA-polε
更长片段:
核酸内切酶→DNA-polβ
PCNA(增殖细胞核抗原)
重组修复
修复损伤面较大的DNA分子
缺口部分与健康母链交换,复制后稀释损伤链
RecA、RecB、RecC
SOS修复
DNA损伤广泛至难以继续复制而诱发出的修复机制
Uvr、Rec、LexA等
第十一章
一、复制与转录过程的异同点
复制与转录过程的异同点见表11-1。
表11-1 复制与转录过程的异同点
复 制
转 录
特点
半保留复制
不对称转录
模板
双链均复制
仅模板链转录
原料
dNTP(N=A、T、C、G)
NTP(N=A、U、C、G)
酶
依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP)
依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)
产物
子代双链DNA
mRNAtRNArRNA等
碱基配对
A=T、G≡C
A=U、G≡C、T=A
引物
需要
不需要
二、不对称转录的特点
✧结构基因:
能转录出RNA的DNA区段。
✧不对称转录:
转录的选择性。
✧模板链:
DNA双链中按碱基配对规律指引转录生成RNA的一股单链。
✧编码链:
DNA双链中,与模板链对应的另一条链。
三、原核生物与真核生物的RNA聚合酶
原核生物的RNA聚合酶
见表11-2。
表11-2 原核生物的RNA聚合酶
亚基
酶分子中的亚基数
功 能
说 明
α
2
决定哪些基因被转录
转录时不脱落
β
1
与转录全过程有关(催化)
利福平或利福霉素的作用位点
β’
1
结合DNA模板(开链)
是RNA-pol与DNA模板结合相依附的组分,也参与转录全过程
σ
1
辨认起始点
转录延长时脱落
✧由ααββ’构成的聚合酶称为聚合酶的核心酶
✧由ααββ’σ构成的聚合酶称为聚合酶的全酶
真核生物的RNA聚合酶
见表11-3。
表11-3 真核生物的RNA聚合酶
酶分子中的亚基数
功 能
对鹅膏蕈碱反应
RNA聚合酶I
多个
生成45S-rRNA
耐受
RNA聚合酶II
多个
生成hnRNA
极敏感
RNA聚合酶III
多个
生成5-SrRNA、tRNA、snRNA
中度敏感
模板与酶的辨认结合
✧操纵子:
每一个转录区段可视为一个转录单位。
✧RNA聚合酶与启动子区域结合起始转录。
✧-35区的一致性序列:
TTGACA,是RNA-pol对转录起始的辨认位点。
✧-10区的一致性序列:
TATAAT,称为Pribnow盒。
形成稳定的酶-DNA复合物,开始转录。
四、原核生物的转录过程
转录起始
✧转录起始复合物=RNA-pol(ααββ’σ)-DNA-pppGpN-OH3’。
✧原核生物需要σ因子辨认转录起始点。
✧被辨认的区域就是-35区的TTGACA序列。
✧转录起始的第一核苷酸以GTP或ATP常见,又以GTP更为常见。
✧第一个磷酸二酯键生成后,σ因子即从转录起始复合物上脱落。
转录延长
✧转录延长的反应式:
(NMP)n+NTP-----→(NMP)n+1+PPi。
✧转录空泡:
酶-DNA-RNA形成的转录复合物。
✧核酸碱基配对的稳定性:
G≡C>A=T>A=U。
✧转录产物的延长方向是5’→3’。
转录终止
✧依赖Pho的转录终止
✓Pho因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质。
✓Pho因子能结合RNA,又以对polyC的结合力最强。
✓Pho因子还有ATP酶活性和解螺旋酶活性。
✧非依赖Pho的转录终止
✓DNA模板上靠近终止处的特殊碱基序列,转录出RNA后,形成特殊的结构来终止转录。
五、真核生物的转录过程
转录起始
✧-25区域的TATA序列,启动子的核心序列,称为TATA盒。
✧顺式作用元件:
DNA分子上具有的可影响(调控)转录的各种组分,包括
✓启动子、增强子、沉默子
✧反式作用因子:
能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质
✓转录因子:
能直接、间接结合RNA聚合酶反式作用因子。
✓上游因子:
与上游序列如GC、CAAT等顺式作用元件结合的蛋白质。
✓诱导因子:
能结合应答元件,只在某些特殊生理情况下才被诱导产生的。
✧转录起始前复合物(PIC):
ⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合体
转录延长
“一有一无”
✧有核小体移位和解聚现象。
✧无转录与翻译同步的现象。
转录终止
✧转录终止的修饰点:
读码框架的下游的一组共同序列AATAAA,再下游还有相当多的GT序列
六、真核生物的转录后修饰
真核生物mRNA的转录后加工
✧首尾的修饰
✓5’端修饰是加上GpppmG—的帽子结构,在核内完成。
✓3’端修饰是加上聚腺苷酸尾巴(polyAAAAAA),在核内完成。
✓维持mRNA作为翻译模板的活性,增加本身稳定性。
✓组蛋白基因的转录产物,初级或成熟的,都没有polyA尾巴。
✧mRNA的剪接
✓hnRNA和snRNA
∙hnRNA:
核内的初级mRNA,和DNA模板链可以完全配对。
∙断裂基因:
真核生物结构基因,由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质。
∙snRNA:
核内小RNA,尿嘧啶含量最丰富。
∙snRNP:
由snRNA和核内蛋白质组成小分子核糖核蛋白体,作为RNA剪接的场所。
✓外显子定义:
在断裂基因及其初级转录产物上出现,并表达为成熟RNA的核酸序列
✓内含子定义:
隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列
分类:
根据基因的类型和剪接的方式,分为四类
∙第I类:
主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因。
∙第II类:
也发现于线粒体、叶绿体中,转录产物是mRNA。
∙第III类:
是常见的形成套索结构后剪接,大多数的mRNA基因有些类内含子。
∙第IV类:
是tRNA的基因及其初级转录产物中的内含子,剪接过程需要酶和ATP。
✓mRNA的剪接:
去除初级转录产物上的内含子,把外显子连接为成熟的RNA的过程。
∙剪接接口:
5’GU……AG-OH-3’序列,又称为边界序列。
∙二次转酯反应:
剪接过程的化学反应。
✧mRNA的编辑:
是遗传信息在转录水平上发生改变,由一个基因产生不止一种蛋白质的现象
∙分化加工:
基因的编码序列经过转录后加工,可有多用途分化。
tRNA的转录后加工
✧由RNA-polⅢ催化生成。
✧5’端前导序列由RNaseP切除,该酶的辅酶是由300个核苷酸的RNA所组成。
✧3’端由tRNA核苷酸转移酶加入CCA-OH作为末端。
✧还包括稀有碱基的生成
⑴甲基化;⑵还原反应;⑶核苷内的转位反应;⑷脱氨反应;⑸加CCA-OH的3’端
rRNA的转录后加工
✧真核生物核内的45S的转录产物,是三种rRNA的前身。
✧小亚基的是18S-rRNA。
✧大亚基的是5.8S、28S的rRNA。
核 酶
✧定义:
具有催化活性的RNA。
✧通常为60核苷酸左右,包括有催化部分和底物部分。
✧含有RNA的酶:
端粒酶、snRNP、核酶。
第十二章
一、参与蛋白质生物合成的体系
mRNA是翻译的模板
✧顺反子:
编码一个多肽的遗传单位。
✧多顺反子:
原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位,转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质。
✧单顺反子:
真核生物的一种mRNA只编码一种蛋白质。
✧遗传密码:
在mRNA信息区,相邻3个核苷酸组成1个三联体的遗传密码,编码一个氨基酸或一种信号。
✧开放阅读框(ORF):
从5’端起始密码子AUG到3’端终止密码子间的核苷酸序列,各三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链。
遗传密码
✧起始密码:
AUG。
✧终止密码:
UAA、UGA、UAG。
✧遗传密码的连续性:
ORF中的密码子无间断也无交叉。
✧遗传密码的简并性:
除甲硫氨酸与色氨酸只对应一个密码子,其他氨基酸都至少有两个密码子编码。
✧遗传密码的通用性:
从原核生物到人类,密码子都通用。
✧遗传密码的摆动性:
见表12-1。
表12-1 密码子与反密码子的摆动性
tRNA反密码子上第1位碱基
I
U
G
A
C
mRNA密码子上第3位碱基
U、C、A
A、G
U、C
U
G
核糖核蛋白体是多肽链合成的装置
原核、真核生物核糖核蛋白体的组成见表12-2。
表12-2 原核、真核生物核糖核蛋白体的组成
原核生物
真核生物
核蛋白体
小亚基
大亚基
核蛋白体
小亚基
大亚基
S值
70S
30S
50S
80S
40S
60S
rRNA
-
16S
5S、23S
-
18S
5S、5.8S、28S
蛋白质
-
21种
36种
-
33种
49种
tRNA与氨基酸的活化
✧氨基酸的活化过程:
氨基酸+tRNA+ATP→氨基酰-tRNA+AMP+PPi。
✧活化过程的关键酶:
氨基酰-tRNA合成酶,催化时消耗两个高级磷酸键。
✧起始肽链合成时的氨基酰-tRNA
表12-3 原核生物与真核生物翻译起始与延长时的氨基酸酰-tRNA
起始
延长
原核生物
fMet-tRNAiMet
Met-tRNAeMet
f(N-formylmethionine)代表甲酰化
Met-tRNAeMet
真核生物
Met-tRNAiMet
Met-tRNAeMet
i(initiator)代表起始
e(elongation)代表延长
二、蛋白质生物合成的过程
肽链合成起始
原核生物与真核生物起始复合物形成的比较见表12-4。
✧S-D序列:
原核生物mRNA起始AUG上上游约8-13个核苷酸部位的一段一致性序列,富含嘌呤碱基,是与小亚基结合的位点。
✧A位:
原核核蛋白体上结合氨基酰-tRNA的位点,由大小亚基蛋白共同组成。
✧P位:
原核核蛋白体上结合肽酰-tRNA的位点,由大小亚基蛋白共同组成。
✧E位:
排出卸载tRNA的排出位,主要是大亚基成分。
表12-4原核生物与真核生物起始复合物形成的比较
原核生物起始复合物的形成
真核生物起始复合物的形成
步骤一
核蛋白体亚基分离
核蛋白体亚基分离
步骤二
mRNA在小亚基上就位
起始氨基酰-tRNA的结合在P位;
结合GTP,起始因子eIF-2
步骤三
起始氨基酰-tRNA的结合在A位
mRNA在小亚基上就位;
消耗ATP,
步骤四
核蛋白体大亚基结合
核蛋白体大亚基结合;
水解GTP
肽链的延长
✧核蛋白体循环:
肽链的延长在核蛋白体上连续性循环进行的方式。
✧每一次核蛋白体循环有三个步骤:
进位、成肽、转肽,增加一个氨基酸(见表12-5)。
✧每增加一个氨基酸,至少消耗4个高能磷酸键(氨基酸活化时两个,进位转位各一个)
✧肽链合成的延长因子的生物功能见表12-6。
表12-5原核生物的核蛋白体循环过程
进 位
成 肽
转 肽
概念
根据mRNA下一组遗传密码指导,使相应氨基酰-tRNA的结合在A位,又称注册
转肽酶催化的肽键形成过程
起始二肽酰-tRNA-mRNA相对移进入P位,卸载的tRNA移入E位
需要的延长因子
EF-T
――
EF-G
是否耗能
GTP水解
――
GTP水解
表12-6肽链合成的延长因子
原核生物翻译延长因子
生物功能
对应真核生物翻译延长因子
EF-Tu
促进氨基酰-tRNA进入A位,结合分解GTP
EF-1-α
EF-Ts
调节亚基
EF-1-βγ
EF-G
有转位酶活性,促进二肽酰-tRNA-mRNA相对移进入P位,卸载的tRNA移入E位
EF-2
肽链合成的终止
✧核蛋白体A位出现终止密码时,合成停止,肽链从肽酰-tRNA中释出mRNA,核蛋白体大小亚基分离。
✧终止过程相关的蛋白因子为释放因子(RF)。
原核生物的三种释放因子的比较见表12-7。
表12-7原核生物的三种释放因子
释放因子
功 能
终止过程
RF-1
特异识别UAA、UAG
RF-1或RF-2结合终止密码后触发核蛋白体构象,诱导转肽酶转变为酯酶活性,合成的肽链释出
RF-2
特异识别UAA、UGA
RF-3
GTP酶活性
三、蛋白质合成后加工和输送
多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质
✧分子伴侣(molecularchaperon):
分子伴侣是细胞一类保守蛋白质,可识别肽链的非天然构象,促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。
✧蛋白二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI):
二硫键异构酶在内质网活性很高,可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接,最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。
✧肽-脯氨酰顺反异构酶(peptideprolylcis-transisomerase,PPI):
多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体,空间构象明显差别,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶,在肽链合成需形成顺式构型时,可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。
一级结构的修饰
✧去除N端的甲酰基、蛋氨酸或N端附加序列。
✧个别氨基酸的共价修饰,如磷酸化、羟基化、甲基化等。
✧多肽链的水解修饰,如酶原水解生成有活性的酶。
空间结构的修饰
✧亚基聚合:
针对具有四级结构的蛋白质而言。
✧辅基连接,针对结合蛋白而言。
✧疏水脂链的共价连接。
蛋白质合成后的靶向输送
✧靶向输送:
蛋白质合成后经过复杂机制,定向输送到最终发挥生物功能的目标地点的过程(见表12-8)。
✧信号序列:
所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号,主要为N端特异氨基酸序列,引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位,是决定蛋白靶向输送特性的最重要元件。
表12-8 三种靶向蛋白的输送过程
步骤
进入内质网(ER)的过程
进入线粒体的过程
进入细胞核的过程
步骤一
胞液核蛋白体上合成N端信号肽等氨基酸
新生蛋白结合HSP70或MSF转运到线粒体
蛋白结合输入因子αβ后导向核膜的核孔
步骤二
SRP结合信号肽
信号序列识别受体
GTP水解供能,使蛋白进入核内
步骤三
大亚基锚定ER膜,使信号肽插入ER膜
转运、穿过线粒体的跨内外膜蛋白通道
转位中,输入因子αβ解离,胞核蛋白定位细胞核中
步骤四
信号肽启动肽链转位,肽链进入ER腔
切除信号序列,折叠成功能构象
――
步骤五
HSP70消耗ATP,使多肽进入ER并折叠成功能构象
――
――
四、蛋白质合成的干扰和抑制
抗生素(antibiotics)
某些抗生素抑制蛋白质生物合成
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