生物工程研究生实验内容.docx

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生物工程研究生实验内容

《生物工程综合实验》

实验指导书

张彩莹编写

适用专业：

2016级生物工程专业研究生

生命科学与技术学院

2016年10月

前言

随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。

生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力。

由于该学科是一门实践性较强的科学，所以在培养生物工程专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。

本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等基础课程实验。

这些实验为培养学生的基本操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，所以学生完成实验后没有一个完整的概念。

本课程是在原有课程实验的基础上开设的综合性实验，放弃了原来单独小实验的结构，改为独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。

这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程技术有了进一步的认识。

根据教学计划的安排，本课程设置了两个综合实验：

（1）DNA的分离提取及核酸电泳；

（2）从生物组织中分离提取活性物质及鉴定。

以期通过这两个综合实验的完成，使同学们充分了解生物技术原理并熟练掌握生物活性物质分离、纯化与鉴定的常用方法。

涉及的方法有：

溶剂提取法、酶活力测定、物质含量测定（分光光度法）。

本课程主要以学生自己动手操作为主，教师指导学生完成实验内容，使同学们在开放的实验环境下，充分发挥主观能动性，摸索试验条件，解决具体问题，培养应用基本理论去分析和解决实际问题的能力。

希望通过这些实验和探索，让同学们获得生物工程专业基本的实验技术训练，为今后独立从事科研和开展相关专业工作打下扎实的基础。

实验须知

生物工程综合大实验教学是生物工程专业课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握生物工程专业学生所具备的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。

为此，提出下列实验须知：

1．遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。

若发生事故应立即报告指导教师。

2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，能自行设计实验方案，安排好当天计划，争取准时结束。

实验过程中应养成及时记录的习惯。

凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，及时交给老师。

3．在实验室里要保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，玻璃器皿及时清洗干净，存放在适当的位置，废弃的固体和滤纸等丢入废物桶内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。

4．公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。

对于精密贵重仪器每次使用后应登记使用者姓名并记录仪器设备的使用情况。

节约用水、用电、药用试剂。

严格药品用量。

5．保持实验室的整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物桶，检查水、电和门窗是否关闭。

值日生把当天的情况报告老师后才准予离开实验室。

综合实验一大肠杆菌质粒DNA的小量

提取及核酸电泳

一、实验目的

1.了解质粒在基因工程中的作用。

2.学习碱裂解法小量制备质粒DNA的方法，掌握质粒DNA提取纯化的实验原理。

3.掌握核酸电泳的原理。

4.学习利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。

二、实验原理

质粒是游离于染色体之外的能够独立复制的DNA分子。

大部分质粒呈环状结构，目前亦发现少部分线状质粒。

天然质粒DNA的长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

质粒主要存在于细菌、酵母和一些植物细胞中，有时一个细胞里面可以同时存在一种乃至于数种的质粒。

质粒的拷贝数在细胞里从一个到几千个不等，可分为拷贝数少的严谨性质粒和拷贝数多的松弛型质粒。

质粒携带的基因可以赋予细胞新的生理代谢能力，例如使一些细菌中产生抗药性。

经过修饰后的质粒是基因工程最常用的载体工具，可承载目的基因进入宿主细胞。

本实验采用碱裂解法分离纯化质粒DNA分子，即利用共价闭合环状质粒DNA与线性细菌染色体DNA片段之间存在拓扑结构差异对其进行分离。

破壁释放DNA后，在强碱性（pH12.0-12.5）下线性DNA的两条链会完全变性分离，而闭合环状DNA由于其双螺旋主链骨架的彼此缠绕，互补的两条链虽然变性但仍结合在一起。

当处于低温和中性pH条件下时，共价闭合环状的质粒DNA能迅速而准确地复性，但互补链彼此分离的线性染色体DNA分子的复性作用就不会那么迅速和准确，往往会聚集成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一起被沉淀下来。

离心分离后的上清液经过乙醇沉淀就可得到高纯度质粒DNA。

带电荷物质在电场中的趋向运动称为电泳。

在基因工程研究中，核酸电泳技术已被广泛用于DNA片段的分离纯化和序列分析等诸多方面。

核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的集团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。

浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不一的凝胶，用于分离不同分子量的核酸片段。

DNA分子在碱性环境的电泳缓冲液中带有负电荷，因此在外加电场作用下会向正极迁移。

由于不同DNA分子的分子量、所带电荷和分子构型的差异，在电场中其迁移速率就会出现不同，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH和电泳时的温度等也影响迁移率。

从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。

电泳后，凝胶中的DNA分子用核酸染色剂染色后在紫外灯照射下即可观察到条带。

此外，从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带用于此后的克隆操作。

三、实验仪器、材料与试剂

（一）实验器材与设备

恒温震荡摇床、台式离心机、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、微波炉、制冰机、冰箱、天平、涡旋混合器、微量移液器（1000μl，200μl，10μl）、吸头（1000μl，200μl，10μl）、1.5ml离心管、三角瓶、烧杯、容量瓶、无菌吸水纸。

（二）实验材料与试剂

1.含质粒的大肠杆菌。

待测DNA样品（质粒DNA）、DNA分子量标记

2.其它试剂：

LB液体培养基、Amp溶液或其他抗生素（100mg/ml）、质粒提取试剂盒或（溶液I、溶液II、溶液III）、无水乙醇、70%乙醇，琼脂糖（核酸电泳用），电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。

溶液I：

50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCl（pH8.0）、10mmol/LEDTA（pH8.0）。

配置方法：

1mol/LTris-HCl（pH8.0）12.5ml，0.5mol/LEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.5g，加ddH2O至500ml。

高压灭菌15min，4℃保存备用。

溶液II：

0.2mol/LNaOH、1%SDS。

配置方法：

2mol/LNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配置。

溶液III：

乙酸钾（KAc）缓冲液（pH4.8）。

配置方法：

5mol/LKAc60ml，冰乙酸11.5ml，加ddH2O至100ml。

4℃保存备用。

电泳缓冲液（TAE）：

40mmol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA。

配置方法：

贮存液（5×）：

取24.2gTris溶于适量ddH2O，加入5.71ml冰乙酸，10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），用ddH2O定容至1000ml，4℃保存。

使用时稀释。

上样缓冲液（6×）：

0.25％（w/v）溴粉蓝，50％（w/v）蔗糖水溶液。

配置方法：

取0.025g溴酚蓝溶于10ml40%蔗糖溶液。

4℃保存。

使用时稀释。

四、实验方法和步骤

（一）质粒的提取（小量试剂盒提取）

1）将5ml含有抗生素的LB液体培养基加入到三角瓶（离心管）中，接入含有质粒的大肠杆菌，37℃震荡培养过夜。

2）取1.5ml培养液到1.5ml离心管中，12000g离心1min，弃去上清液。

将离心管倒置于吸水纸上1min，使细菌沉淀干燥。

3）加入250μl溶液I（先加入RNaseA），盖紧管盖，涡旋振荡打散菌体沉淀，使之悬浮于溶液中。

4）加入250μl溶液II，盖紧管盖，快速温和地（以免污染细菌基因组DNA）颠倒5次（勿震荡），作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

5）加入350μl溶液III，盖紧管盖，缓慢颠倒离心管6-8次使之混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

6）12000g离心10min，小心吸取上清液转移到新的1.5ml离心管中，尽量不要吸出沉淀。

溶液III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

7）将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置2min，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8）向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9）向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10）12000g离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液的乙醇会影响后续的实验。

11）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000g离心1min。

12）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000g离心1min。

（二）核酸电泳

1）制胶：

（以制备1.5%12cm×6cm小胶为例）称取0.45g琼脂糖置于三角瓶中，加入30ml电泳缓冲液（1×TAE），摇匀后放入微波炉中加热至琼脂糖完全融化。

待凝胶液冷却至60~70℃时，加入10ul GoldViewⅠ核酸染料，摇动混匀后小心倒入装配好的胶槽（提前插入梳子，梳子距底部1mm）中，使胶液缓慢展开，直到整个胶槽表面形成均匀胶层（胶厚3~5mm）。

室温下静置直至凝胶完全凝固（白色透明），垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

2）加样：

在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。

用微量移液器分别将样品加入胶板的加样孔内。

DNA分子量标记加样量参看说明书。

每加完一个样品应更换一个加样头，以防污染。

加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶面（加样前要先记下加样的顺序）。

3）电泳：

加样后的凝胶板立即通电进行电泳。

电压一般5V/cm（100-150V恒压电泳），样品由负极向正极方向移动。

当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1-2cm处时停止电泳。

4）观察：

戴手套小心将电泳后的凝胶取出，放置于透射紫外光下254nm观察，DNA条带会显示出绿色荧光，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小，拍照保存实验结果。

五、注意事项

1）提取质粒时加入溶液III后复性时间不宜过久，以免基因组DNA分子断裂的小分子DNA片段也被复性留在上清中。

2）为避免细菌染色体DNA过多的断裂成小片段，裂解细胞后应尽量在温和条件下操作，避免剧烈震荡DNA，以减少对裸露DNA分子的机械剪切作用。

3）为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电压不宜过高（通常不高于5V/cm）。

六、思考题