基于ISSR分子标记分析国产姜黄属植物的遗传多样性改1221.docx

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基于ISSR分子标记分析国产姜黄属植物的遗传多样性改1221

研究报告

ResearchReport

基于ISSR分子标记分析国产姜黄属植物的遗传多样性

李洋益1*　雷映霞2*　高刚3　张艳1　邓家彬4　童珊珊1　杨瑞武1**

1四川农业大学生命科学学院,雅安,625014;2四川农业大学小麦研究所,温江,611130;3宜宾学院生命科学与食品工程学院,宜宾,644000;4贵州师范学院地理与旅游学院,贵阳,550018

*共同第一作者

**通讯作者,yrwu@

摘要　为了分析10种国产姜黄属（Curcuma）植物的亲缘关系和遗传多样性，运用ISSR（inter-simplesequencerepeat）分子标记，从80条引物中筛选出23条引物可以对姜黄属物种进行遗传分析，共扩增出198条多态性带，多态性条带比率（PPB）为94.73%。

利用NTSYS-pc软件计算69份材料间的遗传相似系数为0.63~0.98，平均为0.805。

根据ISSR进行聚类分析可将69份材料分为三大类。

结果表明川郁金可能是姜黄的栽培变种，同时种间的亲缘关系与地理环境有一定的关系，因此，ISSR分子标记是一种分析姜黄属植物遗传多样性十分有效的方法。

关键词　姜黄属,ISSR,聚类分析,亲缘关系,遗传多样性

GeneticDiversityAnalysisofChineseCurcumaBasedonISSRMakers

LiYangyi1*　LeiYingxia2*　GaoGang3　ZhangYan1　DengJiabin4　TongShanshan1　YangRuiwu1**

1CollegeofLifeScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,625014;2TriticeaeResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Wenjiang,611130;3LifeScienceandFoodEngineeringCollege,YibinUniversity,Yibin,644000;4SchoolofGeographyandTourism,GuizhouNormalCollege,Guiyang,550018

*Authorscontributedequallytothiswork

**Correspondingauthor,yrwu@

Abstract　ToanalyzerelationshipandgeneticdiversityamongtenspeciesofChineseCurcuma,byusingISSR（inter-simplesequencerepeat）makers,atotalof198productswerefoundtobepolymorphicbasedon23primerspickedof80primersandthepercentageofpolymorphicbands（PPB）was94.73%.WeusedNTSYS-pctocalculateGSvalue,ofwhichthevariousrangesinallthematerialswas0.63~0.98,withanaverageof0.805.AccordingtoISSRanalysis,the69materialscouldbedividedintothreecategories.TheresultsshowedthatC.chuanhuangjiangwasprobablymutationfromC.longaL.,andtherehavebeenacertainrelationshipbetweenthegeneticrelationshipamongthespeciesandgeographicalenvironment.Therefore,ISSRwasausefulmethodtoassessthegeneticrelationshipsamongCurcumaspecies.

Keywords　Curcuma,ISSR,Clusteranalysis,Relationships,Geneticdiversity

姜黄属（Curcuma）为姜科（Zingiberaceae）的一个重要的多年生属，全世界有70余种，主产地为东南亚，同时澳大利亚北部也有分布。

我国现有10与种，主要有广西莪术（Curcumakwangsiensis）、蓬莪术（Curcumaphaeocaulis）、姜黄（Curcumalonga）、郁金（Curcumaaromatica）、川郁金（Curcumasichuanensis），主要分布于中国西南部和东南部（肖小河等,2004）。

姜黄属多种植物的块根和块茎可以入药，中药中的郁金、莪术和姜黄都来源于姜黄属。

姜黄属药用植物具有行气解郁、活血化瘀、利胆清心、消积止痛等功效，具有较高的药用价值（蒋永和,2009），由于姜黄属植物分布广、变异大，不易采到具花标本，并且同物异名和同名异物的现象普遍，很难对姜黄属植物进行分类鉴定，因此有必要用形态学、细胞学、分子生物学等方法对其进行研究。

分子标记已经被证实是一种评价种属间遗传多样性和亲缘关系的有效方法（Guoetal.,2014），近年来，已经普遍用于种质资源遗传多样性研究、遗传图谱的构建、品种鉴定等诸多方面（黄春琼等,2015）。

ISSR（inter-simplesequencerepeat）是一种新型的分子标记技术，它是扩增SSR毗邻区域的多态性（ZiekiewiczEetal.,1994）。

ISSR技术具有重复性好、显性标记和多态性丰富的优点，适合大样本的检测（侯永翠等,2005）。

本研究运用ISSR分子标记技术，从分子水平研究了姜黄属药用植物种间和种类不同居群的遗传多样性，为进一步研究姜黄属植物的资源分类、起源、保存和利用提供一定的参考。

1结果与分析

1.1ISSR多态性分析

经过反复试验的摸索，建立了效果好的PCR扩增体系，从80条引物里面筛选出23条能扩增清晰条带的引物。

对69份实验材料（表1）进行PCR扩增的结果统计（表2）。

23条引物总共获得得到209条清晰的条带，其中多态带有198条，平均每条引物产生9.1条带；多态性检出率为94.73%。

以上数据表明姜黄属植物在分子水平上的遗传多样性比较丰富。

图1是引物ISSR02对69份实验材料的PCR扩增结果。

表1ISSR分子标记的实验材料

Table1ExperimentalmaterialsofISSR

编号Number

材料

Materials

拉丁学名

LatinName

采集地

CollectLocation

YN-01

郁金

C.aromatica

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-02

广西莪术

C.kwangsiensis

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-03

蓬莪术

C.phaeocaulis

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-04

蓬莪术

C.phaeocaulis

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-05

温郁金

Curcuma.wenyujin

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-07

极苦姜黄

Curcuma.amarissima

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-08

极苦姜黄

C.amarissima

勐阿,云南Menga,Yunnan

YN-09

黄花姜黄

Curcuma.flaviflora

勐阿,云南Menga,Yunnan

YN-10

姜黄

C.longa

勐阿,云南Menga,Yunnan

YN-12

郁金

C.aromatica

勐醒,云南Mengxing,Yunnan

YN-13

蓬莪术

C.phaeocaulis

勐阿,云南Menga,Yunnan

YN-15

姜黄

C.longa

西双版纳,云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-16

蓬莪术

C.phaeocaulis

西双版纳，云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-17

蓬莪术

C.phaeocaulis

西双版纳，云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-22

黄花姜黄

C.flaviflora

西双版纳，云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-23

郁金

C.aromatica

西双版纳，云南Xishuangbanna,Yunnan

YN-25

郁金

C.aromatica

勐康，云南Mengkang,Yunnan

YN-26

郁金

C.aromatica

易武,云南Yiwu,Yunnan

YN-27

蓬莪术

C.phaeocaulis

易武,云南Yiwu,Yunnan

YN-28

蓬莪术

C.phaeocaulis

易武,云南Yiwu,Yunnan

YN-29

姜黄

C.longa

易武,云南Yiwu,Yunnan

YN-30

蓬莪术

C.phaeocaulis

易武,云南Yiwu,Yunnan

YN-31

蓬莪术

C.phaeocaulis

勐康,云南Mengkang,Yunnan

YN-32

极苦姜黄

C.amarissima

勐醒,云南Mengxing,Yunnan

YN-33

广西莪术

C.kwangsiensis

勐康,云南Mengkang,Yunnan

YN-34

蓬莪术

C.phaeocaulis

勐康,云南Mengkang,Yunnan

YN-35

广西莪术

C.kwangsiensis

勐康,云南Mengkang,Yunnan

YN-36

广西莪术

C.kwangsiensis

勐康,云南Mengkang,Yunnan

GX-1

GX-2

温郁金

广西莪术

C.wenyujin

C.kwangsiensis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-3

广西莪术

C.kwangsiensis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-4

广西莪术

C.kwangsiensis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-5

广西莪术

C.kwangsiensis

南宁,广西Nanning,Guangxi

GX-6

广西莪术

C.kwangsiensis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-7

郁金

C.aromatica

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-8

蓬莪术

C.phaeocaulis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-9

郁金

C.aromatica

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-10

蓬莪术

C.phaeocaulis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-11

广西莪术

C.kwangsiensis

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GX-12

温郁金

C.wenyujin

广西药用植物园GuangxiMedicinalBotanicalGarden

GD-1

蓬莪术

C.phaeocaulis

番禹,广东Fanyu,Guangdong

GD-2

温郁金

C.wenyujin

三水,广东Sanshui,Guangdong

GD-3

温郁金

C.wenyujin

三水,广东Sanshui,Guangdong

GD-4

顶花莪术

Curcuma.yunnanensis

华县,广东Huaxian,Guangdong

GD-5

顶花莪术

C.yunnanensis

华县,广东Huaxian,Guangdong

GD-6

蓬莪术

C.phaeocaulis

番禹,广东Fanyu,Guangdong

GD-7

顶花莪术

C.yunnanensis

华县,广东Huaxian,Guangdong

GD-8

蓬莪术

C.phaeocaulis

番禹,广东Fanyu,Guangdong

GZ-1

郁金

C.aromatica

安龙,贵州Anlong,Guizhou

GZ-2

蓬莪术

C.phaeocaulis

安龙,贵州Anlong,Guizhou

ZJ-1

温郁金

C.wenyujin

安龙,贵州Anlong,Guizhou

GZ-3

姜黄

C.longa

梅屿,浙江Meiyu,Zhejiang

ZJ-2

温郁金

C.wenyujin

梅屿,浙江Meiyu,Zhejiang

SC-1

郁金

C.aromatica

四川省郁金基地BaseofC.aromatica,Sichuan

SC-2

姜黄

C.longa

龙泉,四川Longquan,Sichuan

SC-3

姜黄

C.longa

崇州,四川Chongzhou,Sichuan

SC-4

姜黄

C.longa

新津,四川Xinjin,Sichuan

SC-5

姜黄

C.longa

乐山,四川Leshan,Sichuan

SC-6

姜黄

C.longa

资阳,四川Ziyang,Sichuan

SC-7

姜黄

C.longa

宜宾,四川Yibing,Sichuan

SC-8

川郁金

C.sichuanensis

四川省郁金基地BaseofC.aromatica,Sichuan

SC-9

川郁金

C.sichuanensis

崇州,四川Chongzhou,Sichuan

SC-10

川郁金

C.sichuanensis

宜宾,四川Yibing,Sichuan

SC-11

川郁金

C.sichuanensis

内江,四川Neijiang,Sichuan

SC-12

蓬莪术

C.phaeocaulis

崇州,四川Chongzhou,Sichuan

SC-13

蓬莪术

C.phaeocaulis

犍为,四川Jianwei,Sichuan

SC-14

蓬莪术

C.phaeocaulis

新津,四川Xinjin,Sichuan

SC-15

蓬莪术

C.phaeocaulis

双流,四川Shuangliu,Sichuan

SC-16

川姜黄

Curcuma.chuanhuangjiang

简阳,四川Jianyang,Sichuan

表2ISSR引物序列和扩增

Table2ISSRprimersequencesandamplification

引物名称

Primers

引物序列（5'-3'）

Sequence（5'-3'）

多态性扩增带数

Scorablepolymorophicbands

总扩增带数

TotalBands

ISSR01

ISSR02

ISSR03

ISSR04

ISSR05

ISSR06

ISSR07

ISSR08

ISSR09

ISSR10

ISSR11

ISSR12

ISSR13

ISSR14

ISSR15

ISSR16

ISSR17

ISSR18

ISSR19

ISSR20

ISSR21

ISSR22

ISSR23

HBH（AG）7

VDV（CT）7

GGA（GAG）2AGGAGA

BHB（GA）7

BDB（CA）7

（TC）8G

HVH（TG）7

（ATG）6

（TC）8RT

GGA（TGGA）3T

（CA）8RC

VHV（GT）7

（AC）8G

GGGT（GGGGT）2G

（TG）8C

（ACC）6

（AC）8YG

（AG）8YC

（GA）8YC

（AC）8YT

（AC）8YA

（CA）8RT

（AG）8G

8

10

11

6

9

10

7

7

11

8

8

10

10

9

9

7

5

12

10

9

7

9

6

8

11

11

8

9

11

7

7

12

8

9

10

11

10

10

7

5

14

10

9

7

9

6

Total

198

209

1.2遗传多样性和聚类分析

通过对供试材料的聚类结果分析可知，69份资源间的遗传相似系数范围为0.63~0.98，平均为0.805，第Ⅰ类群共51份材料，包括5份郁金、17份蓬莪术、8份温郁金、2份黄花姜黄、10份广西莪术、1份川黄姜、5份姜黄、3份顶花莪术；第Ⅱ类群共有4份材料，包括3份极苦姜黄和1份郁金；第Ⅲ类群共14份材料，包括3份蓬莪术、7份姜黄、4份川郁金。

图l引物ISSR02的筛选（M:

DNAmarker1200bp）

FigurelTheelectrophoresisscreeningofprimerISSR02（M:

GenerulerTM1200bpDNAladderplusmarker）

2讨论

ISSR分子标记能灵敏地揭示两个亲缘关系十分相近个体间的差异（Wolfeetal.,1998），聚类图结果显示，姜黄（C.longa）和川郁金（C.sichuanensis）聚在一起，表明它们亲缘关系很近。

陈秀香在提出“川郁金”这个新种时也认为两者的亲缘关系很近，由此得出川郁金极有可能是姜黄的栽培变种（陈秀香等,1984），该结果与肖小河等对国产姜黄属的RAPD分析（肖小河等,2000）和叶表皮纤维图像模式识别的结果一致（肖小河等,2004），对温郁金和川郁金进行RAPD分析中表明两者关系密切，可以认定为同一种（陈毓亨等，1999），但本研究结果显示温郁金（C.wenyujin）和川郁金（C.sichuanensis）并没有聚在一起，说明亲缘关系较远，不可以合并，结果与肖小河的研究结果一致，表明温郁金和川郁金的亲缘关系还需要做进一步的研究。

结果显示蓬莪术（C.phaeocaulis）与顶花莪术（C.yunnanensis）的亲缘关系较远，通过数值分类学研究（肖小河等,2004）和RAPD分子标记两者进行分析，结果表明顶花莪术与蓬莪术遗传距离近，认为两者可以合并（肖小河等,2000）。

但是它们在根茎横断面的颜色上存在差别，与本研究结果具有一定的相似性。

可能由于居群间的差异对实验的结果产生的影响。

另外，ISSR分子标记实验过程中具有不确定因素和局限性，也是导致实验存在误差的原因。

川黄姜除《四川植物志》有较详细的描述外，《中国植物志》等其他资料都未提及到这个种，汤加勇也对6种郁金同工酶进行了分析，通过POD和EST同工酶分析，川黄姜与广西莪术及其他36份材料间谱带差异性极为显著，因此他认为川黄姜作为一个单独的种存在（汤加勇等,2008），而本研究则相反，川黄姜与广西莪术的关系很近，可能广西莪术参与了川黄姜的起源，但是是否把它作为一个单独种存在还有待进一步研究。

在聚类时，部分姜黄、川郁金、郁金等材料没有和其他材料聚在一起，为了了解其可能的因素，有必要做进一步研究。

3材料与方法

3.1实验材料

本研究实验材料是从四川、云南、贵州、广西等地采集，总共有10个种，其中有来自不同居群的，总共69份材料，现保存于雅安四川农业大学教学实验农场（表1）。

3.2基因组DNA提取

基因组DNA的提取采取CTAB法（Doyleetal.,1990）。

用TE溶解自然风干的DNA，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，置于-20℃冰箱备用。

使用前将DNA液体稀释到40ng/μL。

3.3ISSR引物的筛选

结合之前姜黄属遗传多样性的研究结果（邓家彬等,2011），选取亲缘关系较为接近的C.chuanhuangjiang、C.wenyujin、C.sichuanensis和C.longa为模板进行引物筛选，80条ISSR引物由北京华大公司合成。

3.4PCR反应组成和反应程序

PCR反应总体积25µL，其中包含模板DNA（40ng/μL）2μL，10×PCRbuffer（无Mg2+）2.5μL，MgCl2（3mmol/L）1.5μL，dNTP1μL，随机引物1μL，TaqDNA酶（5U/µL）0.3μL。

PCR扩增反应在Bio-RadPCR仪中进行。

按下列顺序进行扩增反应：

94℃预变性3min，每循环94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环。

完成最后一个循环后，在72℃延伸10min。

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物进行检测。

图2基于ISSR分子标记对姜黄属植物的聚类分析

Figure2ClusteranalysisofCurcumaaccessionsbasedonISSRmarkers

3.5ISSR数据的统计与分析

利用人工方法统计条带，同一位置有条带的记为1，无条带或不清晰的记为0。

利用NTSYS-pc软件（Williamsetal.,1990）来计算各供试材料间的Jaccard遗传相似系数（GS）和聚类图。

作者贡献

李洋益、雷映霞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；高刚、邓家彬及张艳完成数据分析，论文初稿的写作；童珊珊参与实验设计，试验结果分析；杨瑞武是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。

全体作者都阅读并同意最终的文