与甘蓝中心柱长相关联的ESTSSR标记分析.docx
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与甘蓝中心柱长相关联的ESTSSR标记分析
园艺学报2014,41(7):
1344–1354http:
//www.ahs.ac.cn
ActaHorticulturaeSinica
E-mail:
yuanyixuebao@
收稿日期:
2014–03–10;修回日期:
2014–06–04
基金项目:
国家重点基础研究发展计划(‘973’)项目(2012CB1139);国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-25);
国家‘863’计划课题(2012AA100101,2012AA100202);农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
*通信作者Authorforcorrespondence(E-mail:
jwcgyq@,zhuangmu@)
与甘蓝中心柱长相关联的EST-SSR标记分析
孙朋朋1,2,刘基生2,张扬勇2,方智远2,刘玉梅2,杨丽梅2,龚义勤1,*,
柳李旺1,李占省2,庄木2,*
(1南京农业大学园艺学院,南京210095;2中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)
摘要:
利用40个EST-SSR标记,对100份甘蓝自交系组成的自然群体进行遗传结构分析,采用
TASSEL3.0软件的GLM(generallinearmodel)和MLM(mixedlinearmodel)模型,对甘蓝中心柱长和
中心柱长/球高比值性状进行关联分析。
结果显示供试材料可分为3个亚群;EST-SSR位点间有较高的多
态性和一定程度的连锁不平衡;以GLM模型分析,共检测出5个标记的7个位点与中心柱长性状相关联,
2个标记的3个位点与中心柱长/球高性状相关联,其中2个位点同时与两个性状相关联;以MLM模型分
析,共检测出3个标记的4个位点与中心柱长性状相关联,1个标记的2个位点与中心柱长/球高性状相
关联,其中2个位点同时与两个性状相关联。
GLM和MLM两种模型同时检测到了与中心柱长/球高相关
联的1个标记的2个位点以及与中心柱长相关联的3个标记的4个位点。
关键词:
甘蓝;EST-SSR;遗传多样性;群体结构;关联分析
中图分类号:
S635.1文献标志码:
A文章编号:
0513-353X(2014)07-1344-11
AnalysisonEST-SSRMarkersAssociatedwithCoreLengthinCabbage
SUNPeng-peng1,2,LIUJi-sheng2,ZHANGYang-yong2,FANGZhi-yuan2,LIUYu-mei2,YANGLi-mei2,
GONGYi-qin1,*,LIULi-wang1,LIZhan-sheng2,andZHUANGMu2,*
(1
CollegeofHorticulture
,
NanjingAgriculturalUniversity
,
Nanjing
210095,
China
;2
InstituteofVegetablesandFlowers
,
ChineseAcademyofAgriculturalSciences
,
Beijing
100081,
China
)
Abstract:
FortyEST-SSRmarkerswereappliedforthegeneticstructureanalysisofanatural
populationcomprised100cabbageinbredlines,andassociationanalysisbetweenmarkersandtwo
agronomictraitsoncorelengthweresubsequentlyperformedusingGLM(generallinearmodel)andMLM
(mixedlinearmodel)programsofTASSEL3.0softwareinthisstudy.Populationgeneticstructure
analysisshowedthat100cabbageaccessionswerecomposedof3subpopulations,andhighpolymorphism
andvariousdegreeoflinkagedisequilibriumweredetectedamongEST-SSRloci.Therewere7allelesof5
markersassociatedwithcorelength,and3allelesof2markersassociatedwithcorelength/vertical
diameterofhead,and2allelesassociatedsimultaneouslywithtwoobservedtraitsunderGLMprogram.
Therewere4allelesof3markersassociatedwithcorelength,and2allelesof1markerassociatedwith
corelength/verticaldiameterofhead,and2allelesassociatedsimultaneouslywithtwoobservedtraits
underMLMprogram.Furthermore,2allelesof1markerassociatedwithcorelength/verticaldiameterof
7期孙朋朋等:
与甘蓝中心柱长相关联的EST-SSR标记分析1345
headand4allelesof3markersassociatedwithcorelengthweredeterminedunderGLMandMLM
programs.
Keywords:
cabbage;EST-SSR;geneticdiversity;populationstructure;associationanalysis
关联分析(Associationanalysis)又称连锁不平衡作图(Linkagedisequilibriummapping)或关联
作图(Associationmapping),是一种以连锁不平衡为基础,鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或
候选基因关系的分析方法(Flint-Garciaetal.,2003;Mylesetal.,2009)。
Thornsberry等(2001)首
次将关联分析方法引入植物研究领域,以92份玉米自交系作为试材,经过关联分析发现
dwarf8
基
因序列多态性与花期性状呈显著相关。
随后关联分析相继应用在玉米(Wilsonetal.,2004;Szalmaet
al.,2005;Tracyetal.,2006;Salvietal.,2007;Beloetal.,2008)、水稻(Baoetal.,2006;Agrama
etal.,2007)、大豆(Junetal.,2008;文自翔等,2008;张军等,2008)、小麦(Breseghello&Sorrells,
2006;Tommasinietal.,2007)、棉花(Abdurakhmonovetal.,2008;Kantartzi&Stewart,2008)、
马铃薯(Gebhardtetal.,2004;Simkoetal.,2006)、甜菜(Hansenetal.,2001)等重要作物中。
在
蔬菜中,Zhao等(2007)运用AFLP技术,通过关联分析获得与白菜类作物开花时间相关的11个
分子标记;翟文等(2011)利用207个InDel标记,对160份白菜类作物通过关联分析,获得了4
个与氮利用效率相关的标记;高颖等(2012)利用57个SSR和InDel标记对80份大白菜自交系及
110份F1杂交种的抽薹开花时间进行关联分析,获得了13个标记的17个位点与抽薹开花时间相
关。
甘蓝(
Brassicaoleracea
var.
capitata
L.)的中心柱长度是其重要的品质性状之一,国内外的相
关研究主要集中在遗传方面(Dickson&Carruth,1967;Chiang,1969;雷建军等,1994;张恩慧
等,1998;陈锦秀等,2007;方荣等,2011)。
本试验中利用40个EST-SSR标记对100份甘蓝自
交系的中心柱长及中心柱长/球高性状进行关联分析,明确群体不同基因型所携带等位基因的种类及
不同等位基因对目标性状的贡献率。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为不同球形、不同成熟期、不同原始来源的甘蓝高代自交系共100份(表1),定植于
中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验农场。
1.2田间试验及性状调查
田间试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京南口实验农场进行。
采用间比法试验设计,每
份参试自交系种在1个小区,每小区种植30株。
在甘蓝成熟期将叶球纵剖后测量中心柱长及球高(李
锡香和方智远,2008),每小区随机选5株,计算平均值。
1.3SSR标记分析
利用改良的CTAB法提取幼嫩叶片基因组DNA,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及浓度。
基于NCBI数据库(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)公开报道的62567条(截止2008年6月)
甘蓝的EST,开发出分布于甘蓝9条染色体上的978对引物(陈琛等,2010),以及补充合成的35
对EST-SSR引物,从1013对引物中选出相对均匀分布的标记300个,随机抽取8份材料筛选出多
态性好、稳定性高的40个标记(表2)用于关联分析。
1346园艺学报41卷
PCR反应总体积20μL,含10×Buffer(25mmol·L-1MgCl2)2.0μL,dNTPs(2.5mmol·L-1)
1.6μL,2.5U·mL-1
Taq
DNA聚合酶0.6μL,PrimerF(5mmol·mL-1)和PrimerR(5mmol·mL-1)
引物各0.8μL,30ng·μL-1模板DNA4μL,高压灭菌ddH2O10.2μL。
PCR扩增先在94℃下预变
性4min,再进行35个循环的变性(94℃,30s)、退火(58℃,30s)、延伸(72℃,60s)步骤,
然后在72℃下继续延伸7min,最后慢慢冷却至10℃。
PCR扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶上电
泳,银染显色。
1.4数据处理与统计分析
1.4.1SSR位点遗传多样性
多态信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC)是表示微卫星DNA变异程度高低的指
标。
利用EST-SSR位点的分子标记数据,计算多态信息含量,PIC=1–ΣPi2,其中Pi表示第i个标
记的等位位点频率。
用40个标记的平均值表示每条染色体或整个基因组的遗传多样性。
标记的
PIC≥0.5,为高度多态性信息标记;0.25≤PIC
<0.5,为中度多态性信息标记;PIC
<0.25,为
低度多态性信息标记(Botsteinetal.,1980)。
1.4.2群体结构分析
使用STRUCTURE2.2(Pritchard&Wen,2003)软件进行群体结构的分析,即基于数学模型对
群体划分亚群,计算材料相应的Q值(材料归属某1个群体的概率)。
首先假定群体存在K个等位
变异频率特征类型数(即服从Hardy-Weinberger平衡的亚群,K未知),每一类群SSR位点由一套
等位变异频率表征,将样本中的各材料归为第K个亚群,使得位点频率都遵循同一Hardy-Weinberger
平衡(文自翔等,2008)。
把K的取值范围设为1~10,将MCMC(MarkovChainMonteCarlo)
开始时的不作数迭代(lengthofburn-inperiod)设为10000次,再将不作数迭代后的MCMC设为
100000次,其它选项为软件默认值,若发现lnP(D)的值(MCMC不作数迭代后所得的对数似然
值)持续增大,没有拐点,则用ΔK来确定K值,ΔK取得最大值时K值所对应的模型后验概率最
大(Evannoetal.,2005),因此ΔK取得最大值时对应的K值即为群体的亚群数。
以SPAGeDi-1.3d
处理基因型数据获得个体间亲缘关系Kinship矩阵。
1.4.3LD的衡量
连锁不平衡(Linkagedisequilibrium,LD),又称等位基因关联,是指同一条染色体上两个等
位基因的非随机相关。
即当位于同一条染色体的两个等位基因同时存在的概率大于群体中因随机分
布而同时出现的概率时,就称这两个位点处于LD状态。
所有LD统计的是实际观测到的位点间的
单倍型频率与期望单倍型频率之间的差异(D)。
LD的度量是对D进行归一化后,用LD系数D’
和
r
2进行检验(Flint-Garciaetal.,2003)。
D’是一个与频率无关的量,完全LD或两位点间无重组时D’=1;无LD或连锁平衡时D’=0。
r
2是与频率有关的量,
r
2=1时说明两位点无重组;
r
2=0与D’=0意义相同。
使用TASSEL3.0软件
估算所用样本内成对SSR位点的D’,用该统计量度量位点间LD的大小(Zhuetal.,2008)。
1.4.4关联分析
利用TASSEL3.0软件一般线性模型(generallinearmodel,GLM)和混合线性模型(mixedlinear
model,MLM),分别把群体结构矩阵(Q值和Q+K值)作为协变量,对所有标记位点与中心柱长
和中心柱长/球高两个农艺性状进行回归分析和关联作图,并计算标记对表型变异的贡献率。
贡献率
表示标记位点对关联性状变异的解释程度,关联效应大的位点具有较高的贡献率。
7期孙朋朋等:
与甘蓝中心柱长相关联的EST-SSR标记分析1347
表1100份甘蓝自交系
Table1100inbredlinesofcabbage
代号
Code
田间编号
FieldNo.
球形
Headshape
成熟期
Maturetime
来源
Source
代号
Code
田间编号
FieldNo.
球形
Headshape
成熟期
Maturetime
来源
Source
112-408圆Round早熟Early印度India
5112-372扁圆Plat晚熟Late日本Japan
212-409圆Round中早熟Mid-early印度India5212-375圆Round早熟Early中国China
312-412圆Round早熟Early印度India5312-388圆Round早熟Early加拿大Canada
412-420圆Round中早熟Mid-early印度India5412-396圆Round早熟Early荷兰Netherlands
512-428圆Round中早熟Mid-early印度India5512-403圆Round早熟Early德国Germany
612-515圆Round早熟Early韩国SouthKorea5612-473扁圆Plat中熟Mid日本Japan
712-522圆Round早熟Early韩国SouthKorea5712-482扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan
812-523圆Round早熟Early韩国SouthKorea5812-519扁圆Plat极晚熟Verylate日本Japan
912-200扁圆Plat晚熟Late中国China5912-524扁圆Plat极晚熟Verylate日本Japan
1012-201扁圆Plat晚熟Late中国China6012-533圆Round中熟Mid俄罗斯Russia
1112-203扁圆Plat中晚熟Mid-late中国China6112-534圆Round晚熟Late俄罗斯Russia
1212-204扁圆Plat中熟Mid日本Japan6212-537圆Round极晚熟Verylate俄罗斯Russia
1312-205扁圆Plat中熟Mid中国China6312-543圆Round中熟Mid荷兰Netherlands
1412-209扁圆Plat中熟Mid中国China6412-570近圆Nearlyround晚熟Late荷兰Netherlands
1512-210扁圆Plat晚熟Late中国China6512-580近圆Nearlyround晚熟Late荷兰Netherlands
1612-211扁圆Plat中熟Mid泰国Thailand6612-587近圆Nearlyround晚熟Late日本Japan
1712-212扁圆Plat中熟Mid日本Japan6712-621近圆Nearlyround中晚熟Mid-late荷兰Netherlands
1812-217扁圆Plat中晚熟Mid-late中国China6812-730圆Round早熟Early日本Japan
1912-222扁圆Plat晚熟Late日本Japan6912-731圆Round早熟Early日本Japan
2012-226扁圆Plat晚熟Late日本Japan7012-733圆Round早熟Early日本Japan
2112-227扁圆Plat晚熟Late日本Japan7112-737圆Round早熟Early日本Japan
2212-228尖Pointed中早熟Mid-early中国China7212-738圆Round早熟Early日本Japan
2312-229尖Pointed中早熟Mid-early中国China7312-741圆Round早熟Early日本Japan
2412-230扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan7412-746圆Round早熟Early日本Japan
2512-235扁圆Plat中熟Mid日本Japan7512-750圆Round早熟Early日本Japan
2612-236扁圆Plat中熟Mid日本Japan7612-752圆Round早熟Early日本Japan
2712-237扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan7712-754圆Round早熟Early日本Japan
2812-240扁圆Plat中熟Mid日本Japan7812-756圆Round早熟Early日本Japan
2912-241尖Pointed中早熟Mid-early荷兰Netherlands7912-760圆Round早熟Early日本Japan
3012-242尖Pointed中早熟Mid-early赞比亚Zambia8012-762圆Round中早熟Mid-early韩国SouthKorea
3112-243圆Round中早熟Mid-early保加利亚Bulgaria8112-773圆Round早熟Early日本Japan
3212-258扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan8212-775圆Round早熟Early日本Japan
3312-264扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan8312-777圆Round早熟Early日本Japan
3412-279扁圆Plat中熟Mid中国China8412-780圆Round早熟Early日本Japan
3512-280扁圆Plat中早熟Mid-early中国China8512-786圆Round中早熟Mid-early韩国SouthKorea
3612-285扁圆Plat晚熟Late日本Japan8612-790圆Round中早熟Mid-early韩国SouthKorea
3712-292扁圆Plat晚熟Late中国China8712-794近圆Nearlyround晚熟Late荷兰Netherlands
3812-293扁圆Plat中熟Mid日本Japan8812-795扁圆Plat晚熟Late荷兰Netherlands
3912-298扁圆Plat晚熟Late日本Japan8912-796近圆Nearlyround中熟Mid丹麦Denmark
4012-300扁圆Plat晚熟Late日本Japan9012-797近圆Nearlyround中早熟Mid-early日本Japan
4112-303扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan9112-800近圆Nearlyround中熟Mid日本Japan
4212-320扁圆Plat晚熟Late荷兰Netherlands9212-805圆Round中早熟Mid-early韩国SouthKorea
4312-328扁圆Plat晚熟Late日本Japan9312-808圆Round早熟Early意大利Italy
4412-343扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan9412-832圆Round早熟Early韩国SouthKorea
4512-347扁圆Plat中晚熟Mid-late日本Japan9512-845圆Round早熟Early日本Japan
4612-352扁圆Plat晚熟Late日本Japan9612-872圆Round早熟Early丹麦Denmark
4712-356扁圆Plat晚熟Late日本Japan9712-873圆Round中早熟Mid-early荷兰Netherlands
481
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- 甘蓝 中心 长相 关联 ESTSSR 标记 分析
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