细胞分裂素检测方法的研究进展.docx
- 文档编号:864836
- 上传时间:2022-10-13
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:46.26KB
细胞分裂素检测方法的研究进展.docx
《细胞分裂素检测方法的研究进展.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细胞分裂素检测方法的研究进展.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
细胞分裂素检测方法的研究进展
细胞分裂素检测方法的研究进展
(作者:
单位:
邮编:
)
【摘要】细胞分裂素是一类重要的植物生长调节激素,对这类激素进行超微定量检测对于揭示其在植物体内的信号转导机理、发挥其对作物生长的调控作用具有重要意义。
本文综述了近年来细胞分裂素各种分析方法的研究进展,包括免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学方法等,介绍了实际样品常用的前处理方法,并讨论了未来的研究发展方向。
【关键词】细胞分裂素,免疫分析法,色谱法,毛细管电泳法,样
品预处理,评述
1引言
细胞分裂素(cytokinins,CTKs)是一类重要的植物生长调节激素,在植物体内广泛参与各种生物过程。
CTKs可以促进植物根部的
形成,以及根部损伤的修复[1]。
CTKs还影响叶绿体的制造和微结构[2],影响植物的光合作用和病原抵抗[3]等。
目前,已被确认的CTKs有40余种[4],所有的天然CTKs都是腺嘌呤衍生物。
表1列出了典型CTKs的结构、名称和简称。
根据其6位N原子(N6)上取代基(R1)的不同,常见的CTKs可分为3类:
异戊二烯型、异戊二烯衍生型和芳香型⑷。
同时,根据其R2的不同又可以将其分为自由碱基型、核苷型、葡萄糖苷型和核苷酸型等。
另外还存在3位N原子或7位N原子上葡萄糖基取代的CTKs[5]。
CTKs在植物体内主要产生于RNA弋谢过程[6],生物学家已经能够通过调节相关基因的表达来控制内源CTKs的含量[7],但是进一步确定CTKs对植物生长的作用还需要准确的内源性CTKs定量分析方法。
另外,植物体内的异戊烯基腺嘌呤(iP)等CTKs的浓度还可以作为反映植物生长环境状况和疾病情况的标志物[8]。
生物测试法(bioassays)是最早采用的CTKs测定方法[9],但是这种方法的专一性和重复性都较差,分析过程复杂、工作量大,适合作为CTKs的定性分析方法,为理化分析方法提供生物活性方面的依据。
由于CTKs在植物体内含量非常低(约为pmol/g),因此,需要高灵敏度的定量分析方法和高选择性的纯化富集样品前处理方法对其进行分析。
本文将从这两方面进行论述。
2分析方法
2.1免疫分析方法
免疫分析方法具有高效液相色谱法(HPLC)等仪器分析方法所不
及的优势及特点:
(1)由于免疫反应的特异性,可用粗提产品直接检测,从而显著提高了测试速度;
(2)免疫分析对特殊仪器的需求较少,分析成本较低;(3)免疫分析方法的灵敏度高。
由于这些优点,免疫分析方法一直在CTKs检测中广泛应用[10〜21]。
异戊烯基腺苷(iPR)和反式玉米素核苷(tZR)作为免疫分析研究中的半抗原,所制得的抗体对N6上的取代基有较好的识别,即对于与半抗原R1不同的分子交叉反应较小。
最早用于CTKs测定的免疫分析方法是放射性标记的免疫分析法(RIA)[10〜13],分别实现了对iPR类[10]和ZR类[11]CTKs的定量检测。
其中Weiler等[11]制备的tZR抗血清对tZ和tZR有高特异性,对表1典型细胞分裂素的结构、名称和简称[5,40]很小,对tZR的检出限达到15pg,线性范围在0.02〜10ng。
该方法被用于西红柿果实粗提物中玉米素含量的测定。
Trione等[12]制备了抗tZR的单克隆抗体,并将其用于tZR的RIA检测,灵敏度达到fmol量级。
由于RIA需要专业的放射性物质操作技术以及特殊的实验室设备,后来逐渐被更易普及和自动化的酶免疫分析(EIA)所取代[14〜
21]。
Hansen等[14]利用抗tZR多抗以及碱性磷酸酯酶标记抗原建立了对tZR和tZ的检测方法,检测线性范围为0.3〜30pmol,同时利用这种方法测定了在玉米茎中tZR和tZ的梯度分布。
Maldiney等[15]将生物素拟亲和素体系引入ZR的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法,使得检出限可以达到3〜5pg,线性范围在1〜1000pg,利用这种技术可以检测100mg西红柿样品中的ZR含量。
Zhao等[16]提出了一种简化的间接竞争ELISA法,将抗体、竞争分子和酶标二抗在同一步中加入,可以缩短检测时间,同时在一定程度上提高了灵敏度(对ZR为1.3倍),但该方法的试剂消耗量更大。
由于CTKs都是小分子,因此在制备抗体时需先将CTKs与载体蛋
白(如牛血清白蛋白(BSA),鸡卵白蛋白(OVA)等)偶联制得全抗原。
文献[10〜20]中所采用的偶联方法都是Erlanger等[22]建立的核苷类分子与蛋白分子上的自由氨基共价偶联的方法(如图1所示)。
Papet等[21]研究了iPR与蛋白的另一种偶联方法。
ELISA和RIA的检测结果表明,这种偶联方法制得的多克隆抗体对iPR和iP具有专一性,
与Z和ZR没有交叉反应。
进一步使用这种抗体制得免疫亲和吸附胶,对iPR的吸附容量达到1mg/L。
图1嘌呤核苷与蛋白的偶联方法[22]
Fig.1Conjunctionofadenosinetoprotein[22]2.2气相色
谱法(GC)
由于CTKs分子挥发性较弱,无法直接用气相色谱(GC)方法来分离检测,所以对CTKs进行GC分离检测都需要先经过衍生化[23〜29]。
Most等[23]首次报道了三甲基硅烷(TMS)衍生物用于CTKs的GC分离检测。
分别制备了iP、玉米素、二氢玉米素、激动素及其相应核苷的衍生物。
制备方法为:
将iP等化合物与双(三甲基硅烷)乙酰胺
(BTMSA在60C的乙腈溶液中反应5min。
衍生前样品需要经过严格的干燥。
虽然这种衍生方法比较简便,但由于在实际操作中难以控制N6上的取代反应,影响了测定结果的重现性。
全甲基化衍生技术由Morris[24]和Young[25]在1977年建立,首先用强碱对CTKs分子进行处理,处理后的产物再与碘甲烷反应。
虽然这种衍生方法在操作上比TMS法要复杂,但它具有以下优点:
(1)全甲基化衍生物更稳定,从而可以进一步用HPLC或其它方法纯化;
(2)
形成的衍生物单一;(3)甲基化后分子量只增加14,而TM舐增加72,分子量的大增使当时的质谱检测方法受到限制。
Morris等[24]通过
对全甲基化衍生物的质谱图进行分析,从长春花的组织中首次检出了天然的Z0昏口ZROGYoung[25]对比了一系列强碱的衍生化效果发现,二甲亚砜碳负离子有很好的效果(二甲亚砜碳负离子由特丁基锂加入二甲亚砜中制得)。
Ludewig等[26]报道了CTKs三氟乙酸衍生物的制备,这类衍生物由于具有很强的电子捕获能力,可以被电子捕获检测器(ECD)高灵
敏地检测而被应用。
这种方法虽然灵敏度较好,但是衍生化时选择性较差。
Bjorkman等[27]比较了使用乙酸酐在不同溶剂、温度、反应时间等条件下对CTKs类分子的乙基化结果,找到了一种简单、回收率高、副产物少的衍生化反应条件,使用GC1MS对衍生化CTKs的定量检测可以达到pmol级的检出限。
这种方法的缺点是:
R3为葡萄糖基的CTKs衍生化产物,在GC1MS系统中不稳定;玉米素类和二氢玉米素类CTKs的衍生物在EIMS谱图中的分子离子峰很弱。
因此,该方法不适于这两类CTKs中新型分子的鉴定。
Birkemeyer等[28]使用N):
甲基MNa(特丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA对tZ、mT以及吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)等植物激素同时进行衍生反应,从而实现用GC);MS对多种植物激素的分离检测,其中对tZ的检出限达到0.9
pmol。
作者采用这种方法对300mg植物根部样品以及秧苗样品中的
植物激素进行了系统分析。
2.3高效液相色谱法(HPLC)
对CTKs进行定量分析的前提是各种CTKs的基线分离,液相色谱由于其强大的分离能力而在CTKs的检测中被广泛应用。
HPLC方法的引入使CTKs的检测水平有了巨大的突破,由于不同的CTKs显示出不同的极性,同时还具有稳定的紫外吸收,利用HPLCUV法对CTKs进行定量分析是最先报道的方法。
使用最多的液相色谱拟质谱联用法
(LC拟MS兼有LC的分离能力和MS的高灵敏度(尤其是MS/MS系统)和高特异性[30〜33],同时MS信号还提供了被分析物的结构信息,为寻找新型CTKs提供了有力的手段。
最初尝试对CTKs进行分离的HPLC方法受到了柱填料的限制,后来非极性固相微粒材料的应用使得HPLC成为了最有效的CTKs分离方法。
1975年,Carnes等[34]成功对iP,Z及其核苷衍生物进行了分离,分离速度达到了传统LC的30倍。
Stahly等[35]利用HPLC寸桃、梨和苹果样品中的玉米素及其核苷进行了分离检测。
如上所述,多种植物激素都具有紫外吸收,故可使用HPLC:
UV
法进行同时的分离和测定。
Ma等[36]以C18反相柱为固定相,使用
甲酸拟三乙胺缓冲溶液和甲醇溶液梯度洗脱,对经过固相萃取(SPE)
纯化富集的椰汁样品中的玉米素和6拟苄基腺嘌呤(BAP)两种CTKs和IAA、ABA赤霉酸(GA)4类植物激素及其它2种化合物进行分离,用光电二极管阵列检测器(DAD)进行检测。
流出峰的归属通过HPLC1ESI拟MS/MSS行确认。
在10卩L的进样条件下对玉米素和BAP的定量限(LOQ)分别达到3.47和3.82卩mol/L。
目前,电喷雾离子化(ESI)在CTKs的MS检测中使用最为广泛[37〜43],Prinsen等[37]首次利用LC1.ESI拟MS/MS的方法检测了CTKs建立了对16种不同CTKs的检测方法,检出限为1pmol。
他们还使用柱上浓缩的方法,在大体积进样的MicroLC和CapillaryLC与MS/MS联用上取得了更低的检出限(在MicroLC上为5fmol,在CapillaryLC上为0.1fmol)[38]。
Nov揶k等[40]报道了用ESI拟单四极杆质谱定量检测植物样品中所有异戊二烯型CTKs的高灵敏度方法。
方法中实现了20种非衍生的天然CTKs的基线分离。
通过柱后分流,将反相色谱柱的流出液同时引入DAD佥测器和MS检测器。
通过对最终流量,去溶剂化温度、去溶剂化气体和电压等离子化参数的优化,确定了ESI的最佳条件。
所测CTKs都主要以分子离子峰[M+H]+的形式被检测,检测线性范围为0.025(0.075)〜100pmol,可以满足常规检测需要。
在实际样品的测定中,样品提取液通过两次不同的离子交换色谱纯化,然后再通
过一种基于CTKs单克隆抗体的亲和免疫纯化。
LC以MS对样品中CTKs含量的测定结果还通过LC分离后的ELISA方法进行了确证。
研究结果表明,该方法可以满足在生物样品中异戊二烯型和异戊二烯衍生型CTKs的检测要求,但由于缺乏同位素标记内标,对于实际样品中芳香型CTKs的检测还需要进一步发展。
快原子轰击(FAB)离子源在CTKs检测方面的应用也有报道。
Astot等[44]使用capLC/frit拟FABImS佥测了经过柱前丙酰化衍生的CTKs建立了选择离子监测模式(SIM)的定量方法。
Tarkowska等[39]和Dole罐al等[45]采用这种方法分别发现了两种新型的CTKs
柱前衍生法在LC分离CTKs中也有使用。
不同类型的CTKs(如碱基型、核苷型、核苷酸型、葡萄糖苷型)的极性分布范围非常广,极性太大会影响待测物在柱上的分离以及流出峰的形状。
Nordstrolm
等[46]研究了丙酰化和苯甲酰化对分离的影响。
经过衍生后的待测物极性降低,延长了柱上的保留时间和ESI的信号强度。
对于丙酰化的Z
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞分裂 检测 方法 研究进展