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D二聚体的检测及临床意义
D-二聚体的检测及临床意义
近年由于血栓性疾病的增多,检验医学即时检验(POCT)在免疫测定技术方面,特别是在出凝血和血栓性疾病的研究上取得了重大的进展。
D-二聚体的检测方法,从传统的定性试验,变为简单快速准确定量的即时检验。
金标全定量快速检测对于血栓性疾病的及时准确诊断、以及对溶栓治疗的疗效监测,是必不可少的重要指标。
一、D-二聚体的形成
正常人纤溶酶和抑制酶之间保持了动态平衡,使血液循环能正常进行。
人体内的纤溶系统,对保持血管壁的正常通透性;维持血液的流动状态和组织修复,起着重要作用。
为维护正常生理状态,在外伤或血管受损的情况下,血栓的形成可防止血液从损伤的血管中流失。
病理状态下,机体发生凝血时,凝血酶作用于纤维蛋白,转变为交联纤维蛋白,同时纤溶系统被激活,降解纤维蛋白形成各种碎片。
γ链能把二个含D片断的碎片连接起来,形成D-二聚体。
D-二聚体水平的上升,代表血块在血管循环系统中形成,急性血栓形成的一个敏感的标记物。
但不具特异性;下列因素如外科手术、创伤、感染、发炎、怀孕、产后等,也会导致凝血酶的产生使D-D水平的上升。
D-二聚体的升高反映了体内存在着凝血及纤溶活性增强的重要分子标志物。
因此它既可反映体内存在着血栓或继续形成的状况,又可反映体内纤溶活性增强的指标,因为纤维蛋白降解产物中,唯有D-二聚体可反映血栓形成后的溶栓活性,对于临床血栓性疾病的诊断和溶栓治疗有着极其重要的价值。
二、D-二聚体检测的方法学的进展
1、三P试验:
FDP碎片X和可溶性纤维蛋白单体FM复合物的定性试验。
缺点:
敏感性差,DIC阳性率30-60%,试验时间长,干扰因素多,采血不顺,溶血均可影响结果,只能定性不能定量。
2、胶乳凝集法:
简单快速
缺点:
敏感性低,定性或定量倍比稀释,费试剂,重复性差。
3、ELISA法:
敏感性高,能定量
缺点:
操作烦,时间长,无法满足急诊需求。
4、免疫渗滤胶体金显色反应法:
采用同种单克隆抗体夹心,即以包被的抗体捕获血浆中抗原(D-二聚体)加入偶联有胶体金的同种抗体显色。
抗体特异性高,可与含D-二聚体的多种片断结合可提高试验的敏感度。
特点:
定量报告,快速简便,敏感性高。
测试范围:
—5mg/L
正常参考值:
使用说明:
(1)血浆未经彻底离心,血浆中含有白细胞、血小板、高血脂或高粘度血浆,这些物质停留在检测板的膜表面,导致渗滤减慢时间过长,可能出现假性高值,应彻底离心(4000转20分钟为宜),并小心吸取血浆。
(2)各个不同厂家的D-二聚体试剂盒的正常参考范围值也不一样,有的以<L为正常,而有的试剂盒以<L为正常。
此外有的以PEU单位模式报告,有的以mg/L的模式报告,其值正好相差一半。
所以在评价D-二聚体结果时应注意上述问题。
三、D-二聚体检测的临床应用
D-二聚体增高提示了与体内各种原因引起的血栓性疾病相关。
同时也说明了纤溶活性的增强;临床上常见于弥慢性血管内凝血(DIC)、深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、急性心肌梗塞、脑梗塞、恶性肿瘤、卵巢癌、肺癌、败血症、肝病、妊高征孕妇、先兆子痫、烧伤、外科手术、创伤和脓毒血症等均可使D-二聚体升高,但是D-二聚体检测的升高并不能说明血栓形成的原因及位置,必须结合临床和其他检测分析结果。
1、DIC(休克、系统感染、外伤、先兆子痫、恶性疾病和烧伤等)的并发症:
血液在全身微小血管内广泛性凝固,形成以血小板和纤维蛋白为主要成分的微血栓。
此过程消耗了大量的血小板和凝血因子,并通过激活途径激活了纤溶系统。
微血栓中交联纤维蛋白被纤溶酶降解而产生大量高于正常百倍的D-二聚体。
与其他诊断DIC的指标相比较,D-二聚体是唯一直接反映凝血酶和纤溶酶生成的理想指标;诊断DIC的特异性也早于其他指标。
2、深静脉血栓(DVT)的筛查:
血浆D-二聚体阴性可排除DVT的可能性。
造影证实DVT者D-二聚体100%阳性,可做溶栓治疗和肝素抗凝的用药指导及疗效观察。
静脉栓塞是临床上最常见的静脉疾病,临床医生无法仅仅根据其临床症状作出诊断。
静脉造影是诊断静脉栓塞的黄金标准,它是创伤性检查,费用高,而静脉造影本身具有引发深静脉栓塞或其它并发症的危险性。
静脉血栓栓塞症(VTE)的危险因素
较低的危险因素
中度危险因素
高危险因素
卧床>3日
膝关节手术
骨折(髋或腿)
长时间的处于静止状态
(如乘车或乘长途飞机)
中央静脉狭窄
髋或膝复位
年龄增大
恶性肿瘤、化疗
大手术
腹腔镜外科
充血性心衰、呼衰
大创伤
减肥
荷尔蒙代替物口服避孕药
脊髓损伤
怀孕/产后
偏瘫性中风
静脉曲张
怀孕/产后
曾患VTE
血栓形成倾向
D-二聚体测试,配合临床评估,可以快速、安全的排除30-50%怀疑DVT/PE的病例,可节省医院的成本,减少不必要的影象诊断及抗凝血治疗,减少病人留院的时间,改善病人的情况,减少入侵性诊断的危险,减少因不必要抗凝血治疗而引起的出血。
D-二聚体可反映血栓大小的变化。
含量再升高,预示血栓再发生。
治疗期间持续较高,提示血栓大小无变化,说明治疗无效。
陈旧性血栓D-D不增高。
3、肺栓塞病人(PE):
PE是一种较常见的潜在致命的疾病,尤其多见于血液病、心脏病和外科手术病人。
PE临床表现差异极大且缺乏特异性(从无任何表现到猝死)、常规检查无法获得直接证据,加上对该病的认识不足,常造成漏诊或误诊。
及时治疗依赖早期诊断。
对于呼吸困难、胸闷、咳嗽、咯血,昏厥的患者,尤其是近期有外伤,手术及长途旅行史;既往患有深静脉血栓,应考虑是否存在PE。
D-二聚体测定是PE必备的筛查方法; D-二聚体测定在急性肺栓塞的筛选中具有重要作用,且操作方法简便、设备要求不高,县市级医院均可开展此项检测。 我国目前应用D-二聚体筛选急性肺栓塞尚处于起步阶段,对其在急性肺栓塞的诊断价值中积累的经验仍然较少,特别是急诊D-二聚体的检测更是刚刚起步,有待于进一步积累临床资料,更好地发挥其在急性肺栓塞中的诊断作用。 4、妇科病人及先兆子痫: Trafatter报告204例先兆子痫妇女中79例D-二聚体增高,而88例正常孕妇全正常。 该指标对妊高征患者高凝状态的诊断、疗效观察及预后判断有重要意义。 D-D检测排除妊娠VTE: 随着妊娠期的发展,孕妇的D-D值随之逐渐升高,可高至基础值的3-4倍。 若妊娠期发生VTE,干扰D-D排除VTE的有效性。 若D-D结果阴性,仍有排除VTE的价值。 5、肝脏疾病: D-二聚体含量明显增高并与肝病的严重程度呈正相关。 恶性肿瘤伴有D-二聚体增高,提示血栓形成及栓塞,对于病情判断及治疗有重要意义。 6、血管疾病: 不稳定型心绞痛病人比急性心绞痛高、急性心肌梗死(AMI)、脑梗塞溶栓治疗时,D-二聚体增高对指导溶栓治疗很有意义。 7、溶血栓治疗的监测: D-二聚体是溶栓药物治疗监控和疗效观察的指标。 应用溶栓药物后D-二聚体明显升高。 若达到疗效,该指标在升高后很快下降;如果二聚体升高后持续维持在一定程度高水平则提示溶栓药物剂量不足。 纤维蛋白降解产物中,唯有D-二聚体可反映血栓形成后的溶栓活性。 因此定量检测D-二聚体可以反映药物溶栓的效果。 应用溶血栓药物(SK、UK、rt-PA等)溶解新鲜血栓,其出血的发生率高达5%~30%,建议Fg维持在~1.5g/L、TT维持在正常对照的~倍,FDPs维持在300~400ug/L。 8、交联衍生物D-二聚体水平的影响 ◆血栓的原始大小(需增加部分解释,就影响状况进行阐述) ◆纤溶速率(需增加部分解释,就影响状况进行阐述) ◆血栓形成时间,肾功正常时,循环中的D-二聚体半衰期约6h;有活跃的纤维蛋白降解和纤溶酶活化;血栓的位置是否被包裹。 (需增加部分解释,就影响状况进行阐述) 四,D-二聚体临床应用时应注意的问题 1、D-二聚体是一项阴性排除试验。 作为一种无创性检查手段,在急性肺栓塞(PE)、深静脉栓塞(DVT)、血管内弥漫性凝血(DIC)排除诊断中有十分重要的价值,它是一项阴性排除试验。 在任何情况下D-二聚体测定值大于试剂盒推荐的CutOff值,都不能简单的作为急性肺栓塞、深静脉栓塞、血管内弥漫性凝血的唯一确诊依据,必须结合临床情况综合分析。 在脑梗死、肺栓塞、弥漫性血管内凝血、急性静脉血栓形成时升高,从D-二聚体的检测目标而言,这些归属阳性升高。 但是只要机体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动,D-二聚体就会升高,比如手术、肿瘤、感染及组织坏死等均可导致D-二聚体升高。 特别对80岁以上人群及住院患者,因患感染性等疾病易引起凝血异常而导致D-二聚体升高的病人应注意结合临床情况综合分析,国际上D-二聚体检测的特异性一般为50%左右。 2、国内外无D-二聚体统一标准品。 D-二聚体是血液中纤维蛋白降解产物,其大小和抗原决定簇不可能完全相同,因此D-二聚体既没有国际标准、国内外均无统一标准品,也无行业标准品。 不同公司的企业D-二聚体标准品也不能相互通用。 因此该试验不同厂家试剂所测的D-D具体数据,不可能互相获得一致的结果也就可以理解了。 但是基本的要求是阴性的排除值和阳性的确定值应总体符合。 有关的权威论述如下: FACT(FibrinAssayComparisonTrial有关纤维蛋白化验的国际专职评估和研究机构)以下由权威的(FACT)研究组发表的原文摘录: “AlthoughD-dimerhasgainedwidespreadclinicaluseasaparameterfordetectionofinvivofibrinformation,thestandardizationissuehasnotbeenresolvedandreferencepreparationsand/orguidelineshavenotbeendistributed.” 中文翻译: 虽然D-二聚体作为纤维蛋白形成的一项指标,在临床巳广泛使用,但其标准化问题至今未解决,也无标准品,甚至有关参照品制备的指导性文件也没有公布过。 ——摘自ThrombHaemost2001;85: 671-8 3、目前D-二聚体试剂溯源标准是如何建立的D-DDOT试剂标准的建立,D-二聚体试剂盒只能向同类公认可靠的D-二聚体测定方法或试剂盒靠拢。 D-DDOT研发时用挪威NycoCard二聚体试剂盒测定患者样品,从中选取高值D-Dimer阳性样品混合,用此NycoCard二聚体试剂盒将这高值Dimer混合血浆系列稀释后定标,作溯源标准,建立D-DDOT试剂盒的二聚体标准曲线、企业D-二聚体标准品、质控品。 本项目方法转移靠混合高值血浆的做法符合国际的通常规定。 有关的权威论述如下: FACT文献摘录: 原文: “ThebestconformityisachievedbytheuseofpooledplasmasamplesfrompatientswithhighlevelsofD-dimerantigeninplasma.” “Asanalternativetopooledplasmasamples,D-dimerantigenassaysmaybecalibratedwithinvitropreparationscontainingpredominantly-fibrinoligomers.” 中文翻译: 使用病人高值D-dimer混合血浆可取得最好的一致性,作为混合血浆样品的代用品,D-二聚体检测可以使用体外制备的标准品校正,体外制备的标准品主要含高分子量纤维蛋白的低聚物。 ——摘自: ThrombHaemost2001;85671-8 4、常见品牌D-二聚体试剂盒的检测量程: 一些品牌D-二聚体试剂盒,为了保证阴性排除判断的敏感性和阳性确定结果的准确性,往往把检测量程定在—5mg/L,这一设计除了满足和保证区分阴阳性区域的敏感性外,更重要的是这种检测量程设计已能满足大部分血栓病人的辅助诊断和溶栓指导的参考。 罗氏金标层析数码定量系统,CARDIACD-Dimer,测量范围: µg/mL法国Stago—4µg/ml(FEU),—L 生物梅里埃D-二聚体测量范围: 45-10,000ng/ml(FEU) (注: FEU→mg/L=mg/L÷2,=。 ) 5、几个常见品牌D-二聚体试剂主要检测数据见下表 几个品牌D-D二聚体试剂比较 试剂名称 方法学 报告单位 正常值 检测范围 检测时间 奥普D-DDOT 金标免疫法 mg/L L 3min Roche(罗氏) 液体试剂717生化仪 FEU ( -9ug/ml(FEU) L 10min Stago法国 专用测定仪 FEU L) -4ug/ml L(FEU) 7min OrganonTeknika 液体试剂 FEU ( -4ug/ml L(FEU) 12min Biomerieux 法国梅里埃 酶免法 FEU <500ng/ml L) 45-10000ng/ml(FEU) L 35min 6、FEU单位和mg/L单位的报告模式及换算方法: 纤维蛋白等值单位(FibrinogenEquivalentUnitsFEU)这是目前一些测定D-二聚体仪器和试剂盒所用的报告模式。 FEU和mg/L之间的换算,FEU1ng/mlD-dimer=2ng/FEU/ml,即FEU;1ng/mlD-dimer=2ng/ml的非FEU单位。 例如如果以D-二聚体正常值<L,换算成FEU结果需乘2即为LFEU。 7、奥普D-二聚体试剂的特点: △保存期长,稳定性好。 12个月的失效期,较常见同类试剂的6个月失效期长了一半。 更方便客户应用。 △阴性结果排除试验的准确性和鉴别排除假阳性结果的临床符合性满意。 本试剂盒在临床评估时发现6例D-D结果全正常范围(5例,1例L),而用进口试剂测数在值在之间、、、、、L),临床追踪证实该6例阳性结果的病人为非血栓病人。 △U2爱国者POCT即时检验仪器,可快速测定CRP、HCG、ALB、D-dimer四个项目,一机多用,有很好的配套效应。 D-DDOT国产试剂的价格优势,与进口试剂等效的产品质量。 8、对D-D检测中可能出现的假阴性和假阳性的评价: D-D检测的阴性患者中(假阴性),仍有极少数患者(<2%)伴静脉血栓,其原因: (1)血栓体积很小/远端小血栓; (2)放射线/超声检查出现假阳性; (3)临床表现与标本采集时间相隔太长; (4)纤溶活性降低 因为D-D增高所谓的假阳性,常见于老年人、孕妇、癌症、DIC、肝病、炎症、创伤、手术、冠心病等均会导致假阳性。 9、不同型号D-二聚体试剂比对检测评估应掌握的基本原则: D-二聚体试剂不同于其它试剂,既没有国际标准、国内外均无统一标准品,也无行业标准、不同公司的企业D-二聚体标准品也不能相互通用。 生物梅里埃在宣传资料中是这样表达的: “D-dimer由于没有统一的标准,不同试剂的测试可有不同的结果。 不同商品D-二聚体试剂盒定量值各不相同,这是因为试剂单克隆抗体的来源/免疫反应性,基质效应,干忧因素、定标物的种类不同等多因素,测试X试剂的结果不一定能与Y测试的试剂比较”,每种D-D试剂通过充份的临床验证,通过观察阴性结果排除试验的准确性和真阳性,以及鉴别排除假阳性结果的临床符合性来评估试剂优劣。 这对于传统用二种数据的比对试验来评价试剂的方法不同,我们必须接受国际上通行的做法,来更新我们的观念。 D-二聚体检测倍受关注的原因分析 中华医学会检验学会主任、解放军301医院主任、丛玉隆教授认为: 随着生化、细胞生物学、免疫学飞速发展;止血、凝血和血栓疾病的研究取得了巨大进步,积极开展血栓与止血试验检测,推广临床应用,无疑具有重要意义。 血栓性疾病的增多,诊断、治疗、监测的临床需要。 检测方法学的进步、从定性到定量,正确快速。 D-二聚体检测试剂盒临床研究总结报告(摘要) 临床研究评估单位: 上海中医药大学岳阳医院 上海闵行区中心医院 一、材料和方法 仪器和试剂: 比对评估系统所用的仪器试剂,均为挪威原装进口的NycoCardD-二聚体测定仪和试剂,与上海奥普生物医药有限公司生产的U2金标斑点法定量读数仪及试剂按各自操作说明作比对测定。 标本采集: 疑似病例组均为临床送检D-二聚体血浆,共135份(闵行医院85例,岳阳医院50例)。 对照组均为健康体检人群共100例(闵行医院40例,岳阳医院60例)。 该组为随机体检人群,未进行挑选,年龄分布在16-85岁,平均年龄为岁。 二、结果 1、疑似病例组以比对法结果为标准,共有88例阳性,46例阴性,1例乳糜血有干扰不作统计。 在阳性组(88例)中,D-DDOT检测出82例阳性,6例阴性,阳性符合率为%(82/88),病例追踪不符合的6例,结果支持D-DDOT的阴性结果。 疑似病例组比对法阴性的46例中,D-DDOT检测均阴性,阴性符合率100%。 阴阳不符的6例均为比对试剂(+),而D-DDOT(-),见表1。 对该阴阳不符的6例进行临床病例追踪,结果显示该6例病例均无深静脉血栓、肺栓塞和血管内弥漫性凝血的相关症状和诊断,病例追踪结果支持D-DDOT的可靠性,在两家医院临床研究中D-DDOT特异性应优于进口同类比对试剂。 对照组以比对法结果为标准,共有1例阳性(闵行119号,mg/L),99例阴性。 该阳性样本D-DDOT检测亦为mg/L,其它99例D-DDOT检测均为阴性,符合率100%。 在列入统计的全部234例样本中,以比对法(NycoCard)为标准结果: 阳性符合率=% 阴性符合率=100% 总符合率=% 配对卡方检测结果显示两者结果在统计学上无显著差别;Kappa值(>),具有非常好的一致性。 以比对法阳性为标准,D-DDOT的阳性符合率虽为%,但2个医院对阳性不符病例(共6例)追踪结果均支持D-DDOT的可靠性。 D-DDOT与比对法(NycoCard)6例阳性不符结果 序号 D-DDOT(mg/L) 比对法(mg/L) 追踪诊断 闵行 肺炎,高血压,非血栓病 闵行 糖尿病,肺炎,非血栓病 闵行 胰头癌,非血栓病 闵行 上消化道出血,肝硬化,非血栓病 岳阳 < 气管炎急性发作,非血栓病 岳阳 高血压,心脏病,非血栓病 2、对照组均为健康体检人群共100例(闵行医院40例,岳阳医院60例)。 该组为随机体检人群,未进行挑选,年龄分布在16-85岁,平均年龄为岁。 以比对法结果为标准,共有1例阳性(闵行119号,mg/L),99例阴性。 该阳性样本D-DDOT检测亦为mg/L,其它99例D-DDOT检测均为阴性,符合率100%。 100例健康人D-二聚体读数分布如下: 在两家医院进行的共100例健康体检人群的临床研究中,二法99%的健康人D-二聚体读数均<mg/ml,表明D-DDOT与比对法一样,所选的正常参考范围<mg/L设置恰当,满足临床需要。 D-DDOT阳性符合率=a/(a+c)=% D-DDOT阴性符合率=d/(b+d)=100% D-DDOT总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)=% 闵行医院和岳阳医院的统计四格表分别进行配对卡方检验,两者P均大于。 三、结论 上海市闵行区中心医院和上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院的临床研究结果表明上海奥普生物医药有限公司申请临床研究的D-二聚体检测试剂盒(胶体金法)和比对法NycoCardD-二聚体单一试剂盒在D-二聚体测定上有良好等效性,引用的正常人参考范围(<mg/L)恰当,D-DDOT可以与比对法一样,在临床用于排除深静脉血栓、肺栓塞和血管内弥漫性凝血,满足临床应用需要。 以比对法阳性为标准,D-DDOT的阳性符合率虽为%,但2个医院对阳性不符病例(共6例)追踪结果均支持D-DDOT的可靠性,提示在本研究D-DDOT特异性应优于同类比对试剂。 检测血浆D-二聚体新金标斑点渗滤法 试剂盒的临床适用性(摘要) 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科张莉 本研究对国产新研制的胶体金法D-二聚体试剂盒作了性能评价,并将其与挪威进口试剂盒的临床测试结果进行了比较。 一、材料与方法 仪器与试剂 D-二聚体检测试剂盒(胶体金法)及配套UppergoldU2金标斑点法定量读数仪和D-DDOT试剂,质控品均由上海奥普生物医药有限公司生产。 比对用挪威NycoCard公司生产D-二聚体试剂盒及配套测读仪NycoCardReaderⅡ。 234份临床收集的新鲜血浆标本,作了线性、精密度(CV)、回收率并用统计软件作了分析。 结果 一、试剂盒性能评价 线性评价: 回归方程为: Y=+,γ=。 此结果显示,该试剂D-D在范围内线性良好。 精密度总批内及批间精密度分别为%和%。 总回收率为%。 二、临床标本比对结果: 234例样本中,二者阳性符合率为%,阴性符合率为100%,总符合率为%。 D-DDOT和Nycocard试剂盒结果具有非常好的一致性。 讨论 目前,D-二聚体的临床检测主要应用街排除静脉血栓栓塞(VTE),其中包括了DVT和PE。 目前快速D-二聚体测定已作为DVT诊断的首选项目。 D-二聚体还是早期诊断弥散性血管内凝血(DIC)较敏感的指标。 这对血栓性疾病的诊断,尤其是对于低临床概率的排除性诊断具有重要的意义。 目前D-二聚体的检测没有国际标准品和行业标准品,各公司的标准品不统一、不通用,通常只适合于与其配套的检测系统的自身校正。 另外,由于各个检测系统所使用的免疫抗体差异较大,抗原决定簇各有不同,从而造成不同的检测方法之间数据差异很大,其阳性率、敏感性、特异性均不同,甚至对于同一个样本(枸橼酸抗凝血浆)的读数亦存在较大差异。 D-二聚体项目目前公认的敏感度在90%以上,而特异性为40%~60%左右[7],因此诊断疾病时,其意义主要在于阴性结果,即它是用于排除性的诊断而非确诊性的诊断。 其阴性符合率达到100%,,阴阳不符的四例病例均为Nycocard试剂盒阳性而D-DDOT阴性,对于注重阴性排除试验的D-二聚体检测项目,这样的结果显示出D-DDOT更具临床适用性。 已上市的23种D-二聚体检测试剂盒之间的比对评估,它们的Spearman等级相关系数在之间。 而D-DDOT与NycoCard的Spearman系数为,说明其与国际知名试剂盒等效。 以上三项临床比对数据的统计指标和对试剂盒基本性能的评价结果均显示D-DDOT完全能够满足临床的需要。 本文摘自: 核心医学期刋“检验医学”2010年1月第1期 D-二聚体检测试剂盒(胶体金法)操作规程(SOP) 一、项目名称检验方法名称 D-二聚体检测试剂盒(胶体金法)D-DDOT 英文名: D-DimerassaybyDIGFAmethod 二、方法学原理 反应原理为固相双抗体夹心法免疫试验。 待测样品中所含的D-二聚体,能为固相在膜上的D-二聚体抗体特异性地捕获,然后由另一个D-二聚体单抗-胶体金缀合物标记,呈红色斑点,斑点红色强度与样品中D-二聚体浓度呈正比,可用U2金标斑点法定量读数仪测定。 三、试剂品牌、规格、内含物: 包装规格: 20人份/盒 D-二聚体定量检测试剂盒(胶体金法) 组份名称 主要活性成分及浓度 数量 1.
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