发酵基础工艺重点.docx
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发酵基础工艺重点
第一章绪论
发酵定义:
通过微生物生长和代谢活动,产生和积累人们所需代谢产物一切微生物培养过程。
发酵工程:
是指运用微生物生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程理论和工程技术体系。
微生物发酵产品分为(按发酵类型):
微生物菌体细胞、酶制剂和酶调节剂、微生物代谢产物(涉及初级代谢产物和次级代谢产物)以及微生物转化、工程菌发酵产物等。
发酵培养办法:
表面培养发酵法和深层培养发酵法。
液体深层培养法基本工艺过程:
菌种选育、孢子制备、种子制备、发酵培养、发酵液预解决、提取精制、成品检查、成品包装。
第二章菌种选育
工业发酵三个技术领域:
菌种选育、发酵工艺(上游工程)和分离提取工艺(下游工程)。
菌种选育在发酵生产上目:
提高发酵产量、改进菌种性能、产生新发酵产物、去除多余组分。
微生物突变修复:
光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统、DNA聚合酶校正作用。
菌种选育办法:
自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程育种、原生质体育种。
自然选育(naturalscreening):
是指运用微生物在一定条件下产生自发突变原理,通过度离、筛选排除衰退型菌株,从中选出维持或高于原有生产菌株过程,以达到稳定或提高生产目。
菌种退化:
菌种在长期传代保存过程中,由于自发突变使菌种变得不纯,生产能力下降。
因素有菌种遗传特性变化、经诱变剂解决后退化变异、菌种生理状况变化(培养条件)。
自然选育普通过程:
单孢子悬浮液制备、分离出单菌落、单菌落传斜面、摇瓶初筛、菌种保藏、摇瓶复筛、放大实验。
诱变育种(mutationbreeding)是运用物理或化学诱变剂解决均匀分散微生物细胞群体,增进其突变率大幅提高,然后采用简便、高效筛选办法,从中选出少数具备优良性状突变菌株。
重要涉及出发菌株选取、诱变解决和筛选突变株三个某些。
诱变育种环节:
出发菌株选取、悬浮液制备、诱变解决、中间培养、突变株分离和筛选。
自发突变:
微生物未经人为诱变剂解决或杂交等生物技术手段而自然发生突变。
诱发突变:
人为用化学、物理诱变剂解决微生物而引起突变。
表型延迟:
微生物表型变化总是落后于基因型变化现象。
理性化筛选(定向筛选):
运用遗传学、生物化学原理,依照产物已知或也许生物合成途径、代谢调控机制和产物分子构造来进行设计和采用某些筛选办法,以打破微生物原有代谢调控机制,获得能大量形成产物高产突变株。
初级代谢产物高产菌株筛选:
筛选细胞膜透性变化突变株、筛选营养缺陷型突变株、筛选构造类似物抗性突变株。
次级代谢产物(重要是抗生素)高产菌株筛选:
筛选营养缺陷型突变株、筛选负变株或零变株回答突变株、筛选去磷酸盐调节突变株、筛选去碳源分解代谢调节突变株、筛选氨基酸构造类似物抗性突变株、筛选二价金属离子抗性突变株、筛选前体或前体构造类似物抗性突变株、筛选自身所产抗生素抗性突变株。
影响原生质体制备因素:
培养基构成、菌龄、酶浓度、酶解温度和PH、酶解时间、渗入压稳定剂。
影响原生质体再生因素:
再生培养基构成、培养基中水分、菌体生理状态、稳定剂、酶作用浓度及时间。
原生质体融合普通过程:
遗传标记选取、再生亲本原生质体制备、原生质体融合、原生质体再生、融合子选取。
第三章培养基
培养基:
人工配制、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物各种营养物质混合物。
培养基成分涉及:
碳源(能源)、氮源、磷源、硫源、无机盐、水、生长因子、前提、增进剂、抑制剂等。
速效碳源、氮源和迟效碳源、氮源
生理酸性(碱性)物质:
通过微生物代谢作用后,形成酸性(碱性)物质营养成分。
前体:
微生物代谢产物合成过程中,能直接被微生物运用构成产物分子构造一某些,而化合物自身构造没有大变化物质。
诱导物:
普通指某些特殊小分子物质,在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后,可以诱导代谢产物生物合成,提高发酵产量。
增进剂:
是指那些细胞生长非必须,但加入后却能明显提高发酵产量某些物质,常以添加剂形式加入发酵培养基中。
抑制剂:
发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径进行,同步会使另一代谢途径活跃,从而获得所需代谢产物,或使正常代谢产物中间产物积累物质。
发酵生产培养基:
孢子培养基/斜面培养基,种子培养基,发酵培养基和补料培养基。
影响培养基质量因素:
原材料质量、水质、灭菌、培养基粘度。
培养基筛选办法:
单因子实验法、正交实验、均匀设计。
第四章灭菌与除菌
染菌危害:
消耗基质或产物,导致生产能力下降;反映异常(pH值),提取更加困难;生产菌细胞将被裂解,使生产失败。
湿热灭菌法:
运用饱和蒸汽灭菌,使微生物体内蛋白质发生凝固作用而致死。
特点是蒸汽有很强穿透力,冷凝时放出大量潜热,来源以便,价格低廉,灭菌效果好,是当前最基本适合培养基和设备灭菌办法。
普通条件为:
121℃,30min。
热阻:
微生物在某一特定条件(重要指温度和加热方式)下致死时间。
相对热阻:
某种微生物在某一条件下致死时间与另一种微生物在相似条件下比值。
对数残留定律和对数穿透定律,t=2.303/k*lg(N0/Nt)和L=1/K*ln(N0/NL)
分批灭菌:
将配制好培养基输入发酵罐内,用直接蒸汽加热,达到灭菌规定温度和压力后维持一定期间,再冷却至发酵规定温度,这一工艺过程称分批灭菌(实罐灭菌)。
长处:
设备规定低,操作简便。
缺陷:
①营养成分有损失;②罐运用率低;③不能采用高温迅速灭菌工艺
持续灭菌:
将配备好培养基在向发酵罐等培养装置输送同步进行加热、保温、和冷却而进行灭菌。
长处:
①可采用高温短时灭菌,培养基受热时间短,营养成分破坏少,有助于提高发酵产率;②发酵罐运用率高;③可采用高温短时灭菌。
缺陷:
不适合容积小发酵罐。
空气除菌办法:
辐射杀菌、热杀菌 、静电除菌、过滤除菌。
深层过滤原理:
微粒气流运动方向变化引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击滞留、阻截滞留、重力沉降、布朗扩散、静电吸附等作用而把微粒滞留在纤维表面上
空气过滤除菌设备:
前过滤器、空气压缩机、冷却器、分水器、储气罐、加热器、总过滤器等。
无菌检查办法:
肉汤培养法、显微镜检查法(镜检法)、平板划线培养或斜面培养检查法
染菌来源:
空气系统、设备、培养基、种子、工艺操作等
第五章菌种制备与保藏
发酵生产中种子必要满足条件:
生长活力强、生理形状稳定、菌体数量足够、无杂菌污染、生产力稳定。
生产菌种制备普通涉及两个过程:
孢子制备和种子制备。
菌种进入种子罐两种办法:
孢子进罐法(生长快)和摇瓶菌丝进罐法(生长慢)。
种子制备:
将固体培养基上培养出孢子或菌体转入到液体培养基中培养,使其繁殖成大量菌丝或菌体过程。
n级种子——n+1级发酵
种子罐级数取决于:
菌种性质;菌体生长速度;发酵设备合理运用。
影响孢子质量因素:
培养基、培养温度和湿度、培养时间和接种量。
影响种子质量因素:
培养基、培养条件、种龄和接种量。
菌种保藏目:
保持优良菌种生产性能稳定、不污染杂菌、不死亡。
原理:
依照菌种生理生化特性,人工创造条件使菌体代谢活动处在休眠状态
菌种保藏办法:
斜面低温保藏法、液体石蜡封存保藏法、固体曲保藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温保藏法。
引起菌种退化因素重要有:
基因突变、变异菌株性状分离、持续传代;其他因素:
温度、湿度、培养基、培养条件
第六章发酵过程中供养
摄氧率γ(OUR,OxygenUptakeRate):
单位体积培养液每小时消耗氧量。
呼吸强度QO2:
单位重量干菌体在单位时间内所吸取氧量。
呼吸临界氧浓度:
在溶氧浓度低时,呼吸强度随溶解氧浓度增长而增长,当溶氧浓度达某一值后,呼吸强度不再随溶氧浓度变化而变化,此时溶氧浓度称为临界氧浓度。
影响微生物需氧量因素:
微生物种类和生长阶段、培养基构成、培养液中溶解氧浓度、培养条件、CO2影响。
氧传递阻力:
供养阻力和需氧阻力。
氧传递速率N=KLa(C*-CL),影响供氧重要因素有KLa和氧传递推动力C*-CL
气泛点:
在特定条件下,通入发酵罐内空气流速达某一值时,使搅拌功率下降,当空气流速再增长时,搅拌功率不再下降,此时空气流速称为“气泛点”(Floodingpoint)。
发酵液中溶解氧浓度测定:
亚硫酸钠测定法、(普遍采用)复膜氧电极测定法
第七章发酵过程控制
发酵类型(按操作方式):
分批发酵、补料分批发酵和持续发酵。
按与氧关系:
需氧发酵和厌氧发酵。
按发酵动力学参数关系:
生长偶联型、某些生长偶联型和非生长偶联型。
初级代谢:
细胞在生命活动过程中进行与菌体生长、繁殖有关一类代谢活动,其产物即为初级代谢产物。
特点:
生长分为几种阶段(延迟期、对数期、稳定期、死亡期);营养物质消耗与菌体生长密切有关;代谢产物合成与菌体生长紧密有关。
次级代谢:
菌体生长阶段、产物合成阶段、菌体自溶阶段3个阶段。
菌体浓度(cellconcentration):
单位体积培养液中菌体含量。
影响因素:
微生物种类和遗传特性、营养物质种类与浓度、菌体生长环境条件。
临界菌体浓度:
为获得最高生产率,需采用摄氧速率与传氧速率相平衡时菌体浓度,称~,是菌体遗传特性和发酵罐传氧特性共同影响成果。
最适菌体浓度:
在一定发酵条件下,使微生物呼吸不受抑制时最大菌体浓度。
碳源浓度控制办法:
经验办法(中间补料)、动力学办法(依照菌体比生长速率、产物比合成速率、糖比消耗速率来控制)。
发酵培养基普通选用迅速运用和缓慢运用氮源构成混合氮源。
抗生素发酵,普通采用生长亚适量磷酸盐浓度。
温度对发酵影响:
影响酶活性、影响发酵液物理性质、影响代谢产物合成方向。
发酵热:
就是发酵过程中释放出来净热量,是各种产生热量减去各种散失热量所得净热量。
生物热:
微生物在生长繁殖过程中产生热量;影响因素有菌种、培养基、培养时间和菌体呼吸强度。
最适发酵温度选取:
依照不同发酵阶段和发酵条件,选取最适温度。
pH对发酵影响:
影响酶活、影响基质或中间产物接力状态、影响发酵产物稳定性。
影响发酵pH变化因素:
菌种遗传特异性、培养及成分、发酵工艺条件。
发酵过程pH拟定:
依照发酵阶段控制(普通5-8)和发酵实验成果。
控制pH办法:
调节培养基构成、补料、加入缓冲剂、加入酸或碱、变化发酵条件。
引起溶氧异常下降因素:
1)污染好气性杂菌;
2)菌体代谢发生异常现象,需氧规定增长;
3)设备或工艺控制发生故障或变化
引起溶氧异常升高因素:
1)菌体代谢浮现异常,耗氧能力下降;
2)污染烈性噬菌体(影响最为明显),产生菌未裂解前呼吸已受抑制,直到菌体破裂完全失去呼吸能力,溶氧直线上升
溶氧控制普通方略:
前期不不大于临界溶氧浓度,中后期满足产物形成。
发酵初期采用小通风,停搅拌
CO2影响:
对微生物生长和发酵具备刺激或抑制作用;通气搅拌是控制CO2浓度一种办法。
补料分批培养(FBC):
又称半持续培养或半持续发酵,指在分批培养过程中,间歇或持续地补加一种或各种成分新鲜培养基培养办法,是分批培养和持续培养之间一种过渡培养方式。
补料分批培养长处(与分批培养比):
可以解除培养过程中底物抑制、产物反馈抑制、葡萄糖分解阻遏效应;可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多导致细胞大量生长、耗氧过多以致通风搅拌设备不能匹配状况;可为发酵过程自动控制和最优化控制提供必须办法。
FBC作用:
控制抑制性底物浓度、解除或削弱分解产物阻遏、使发酵过程最佳化。
FBC补料原则:
控制微生物中间代谢,使之向着有助于产物积累方向发展。
泡沫形成因素:
通气搅拌强烈限度、培养基原料构成、菌种、灭菌质量、发酵液物理性质。
泡沫不利影响:
装料系数减少、氧传递系数减少、染菌几率增长、菌体呼吸受阻。
泡沫控制:
调节培养基中成分及变化发酵工艺、消除泡沫(机械消沫和消沫剂消沫)。
第八章次级代谢产物合成
初级代谢产物:
与微生物生长密切有关代谢产物,涉及氨基酸、蛋白质、核酸、维生素等。
重要特点有微生物生长所必须、各种微生物所共有。
次级代谢产物:
与微生物生长繁殖无关代谢产物,涉及色素、抗生素、生物碱、毒素等。
重要特点:
菌属特异性、特定生长阶段产物及多组分混合物。
分叉中间体:
微生物代谢过程中,既可以被微生物用于合成初级代谢产物,又可以用于合成次级代谢产物中间代谢物,如α-氨基己二酸。
初级代谢产物与次级代谢产物关系:
初级代谢产物是次级代谢产物前体,并影响次级代谢产物合成。
合成次级代谢产物构建单位:
氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮体及其衍生物、核苷酸衍生物等。
次级代谢产物合成过程:
构建单位合成、构建单位连接、产物合成后修饰。
第九章次级代谢产物合成调控
在发酵工业中,调节微生物生命活动办法诸多,涉及生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上各种调节。
次级代谢产物生物合成重要调控机制有:
诱导调节、反馈调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节、生长速率调节及化学调节因子调节。
微生物代谢调节:
酶代谢调节——酶活性调节、基因调节——酶合成调节
(反馈调节)反馈阻遏与反馈抑制:
调控水平分别是DNA水平(表达阻遏蛋白,产生效应慢)和酶分子变构(变构效应,产生效应快)。
酶活力调节:
是指一定数量酶通过其分子构象或分子构造变化来调节其催化反映速率,普通是通过激活或抑制已有酶活力来实现,其特点是反映迅速。
酶激活剂重要是金属离子
代谢激活作用:
前体激活、代谢中间产物激活
酶活性抑制重要是反馈抑制
酶合成调节是通过酶量变化来控制代谢速率水平上起作用,涉及合成诱导(乳糖操纵子)和合成阻遏(色氨酸操作子)。
酶合成诱导作用可体现出协同诱导和顺序诱导两种状况。
对诱导调节控制惯用手段有:
添加诱导物类似物、添加辅酶或辅助因子、运用构成型突变株
克服反馈调节,可从如下两方面着手:
减少末端产物浓度、应用抗反馈突变株
营养缺陷型:
是指原菌株因基因突变致使合成途径中断,丧失了合成某种必要物质能力,而必要在培养基中加入相应物质才干正常生长突变菌株。
渗入缺陷性是一种特殊营养缺陷型(酶活下降不消失)。
工业上用谷氨酸棒杆菌腺苷酸缺陷型生产肌苷酸(IMP)。
普通状况下,凡是能被微生物迅速运用、增进产生菌迅速生长碳源(氮源),对次级代谢产物生物合成都体现出抑制作用。
如,可迅速运用葡萄糖致使青霉素产量特别低,而缓慢运用乳糖却能较好地生产青霉素。
葡萄糖效应:
葡萄糖有助于菌体生长繁殖,但抑制青霉素合成,而乳糖有助于青霉素合成现象。
氮分解产物调节机制:
阻遏次级代谢产物生物合成酶合成、调节初级代谢继而影响次级代谢产物合成
生产中要克服分解代谢阻遏可采用下列办法:
避免使用有阻遏作用碳源和氮源、流加碳源或氮源、运用抗分解代谢阻遏突变体
磷酸盐调节机制:
增进初级代谢、抑制次级代谢,抑制次级代谢产物前体形成,阻遏次级代谢产物合成中某些核心酶合成、ATP调节作用,磷酸盐调控分子机制。
A因子:
2-异辛酰基-3-羟甲基-γ-丁内酯。
链霉素产生菌灰色链霉菌可以产生一中小分子物质,对链霉素合成起着开关作用。
影响次级代谢产物产量因素及改进办法
调节效应
改进办法及办法
碳分解代谢物阻遏
慢代谢碳源或慢补料
氮分解代谢物阻遏
慢代谢氮源或慢补料或加入磷酸镁形成氨复合物
磷酸阻遏
耐砷突变株
对生产产品毒性
抗性突变株
分泌不好
加表面活性剂或寻找脂肪酸合成障碍突变株
产物自身反馈调节
寻找构造类似物抗性突变株或抗反馈突变株
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